ення ДНК вироблялося поліакриламідом і ізопропанолом.
Виділення ДНК з використанням набору MagneSil Genomic, Fixed System (Promega)
Процес фіксації тканини призводить до утворення поперечних зшивок між білками і ДНК, між ланцюгами ДНК. Це зменшує ефективність ПЛР. В якості сорбенту ДНК в даному наборі використовується парамагнітна смола, ДНК-зв'язує здатність якої обмежена декількома нанограммах.
Аналіз препарату ДНК за допомогою ПЛР в режимі реального часу
У першу чергу було необхідно оцінити якість і кількість ДНК в препараті. Для цього проводилася контрольна ПЛР з праймерами на константних район гена KRAS і підбиралося оптимальне для дельнейшего тестування розведення. Потім проводилася ПЛР з праймерами на 7 мутацій гена KRAS.
Полімеразну ланцюгову реакцію проводили в 25 мкл реакційної суміші, що містить 1 мкл 0,2 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP, 2 мкл 25 мМ MgCl 2, по 1,25 мкл кожного праймера, 1 / 500 V (V-загальний обсяг суміші) барвника Sybr Green, 1/100 V референс-барвника флуорісцеіна), 1? буфер для Taq ДНК-полімерази, 0,2 мкл. SmartTaq ДНК-полімерази, 5 мкл ДНК, виділеної із зразків. Умови ампліфікації: перший цикл: 95 о С - 2 хв.; потім 10 циклів без реєстрації оптичних даних: 94 о С - 20 с., 60 о С - 30 с, 72 о С - 20c; 35 циклів з реєстрацією оптичних даних: 94 о С - 20 с., 60 о С - 30 с, 72 о С - 20 c, 72 о С - 15с - збір оптичних даних.
Таким чином з кожним препаратом ДНК проводилися 8 реакцій: одна контрольна реакція і сім реакцій відповідних різним мутаціям 12 і 13 кодонів.
Глава 3. Результати та обговорення
При тестуванні ДНК методом ПЛР у режимі реального часу, отриманої з парафінових зрізів, у ряді випадків спостерігається низький рівень ампліфікації, причиною якого може бути наявність інгібіторів у розчині ДНК або мала кількість ДНК. При фіксуванні ДНК формаліном утворюються перехресні зшивки між ДНК і білками, між різними ланцюгами ДНК. Мала кількість ДНК пов'язано з недостатньою кількістю пухлинних клітин у зразку.
Причини недостатньої кількості пухлинних клітин в зразку:
) Технічні причини: чи не береться первинний осередок (див. додаток 1); прикордонна зона, де багато нормальної тканини (див. додаток 2); ділянку з низьким процентним вмістом пухлинної тканини в біопсії (див. додаток 3); залишки біопсії, де мало пухлинної тканини (див. додаток 4);
) Морфологічна будова пухлини: багато слизу, мало ракових клітин (див. додаток 5); проростання сусідніх тканин і метастази (острівці ракових клітин серед інших тканин - сполучної, м'язової або очеревині) (див. додатки 6,7);
) Відповідна реакція?? організму: різка запальна реакція; виражений імунну відповідь (див. додаток 8).
Різні методи виділення ДНК дозволяють очистити її від інгібіторів.
Порівняльний аналіз результатів тестування ДНК, виділеної з парафінових зрізів по протоколу до набору QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) і лужним методом
Порівняльний аналіз проводився на 12 зразках пухлинної тканини парафінових зрізів і включав в себе:
) виділення ДНК із зрізів кожного зразка двома способами: по протоколу до набору Qiagen, лужним методом;...
