іток. Флуоресцентний сигнал відразу ж передавався на комп'ютер, де оброблявся комп'ютерною програмою, після чого виводився остаточний результат - нуклеотидних послідовність фрагмента ДНК. Пізніше цей метод був модифікований Пробера з співавторами (Prober et al., 1987), що запропонував наносити мітку на дідезоксітермінатори замість праймерів. Для кожного з ддНТФ був розроблений флуоресцентний барвник свого кольору зі зміщеною довжиною испускаемой хвилі. Такий спосіб мічення дідезоксітермінаторов дозволив здійснювати проведення циклічної PCR в одній Мікропробірки, що містить всі чотири ддНТФ і електрофорез на одній доріжці гелю (Prober et al., 1987). На початку 90-х років були розроблені нові флуоресцентні барвники для ддНТФ, які представляли собою похідні родаміну (dichloroROX для ddG, dichloroR6G для ddA, dichloroR110 для ddC і dichloroTAMRA для ddT); був удосконалений етап електрофорезу і детекції мічених продуктів. Також на початку 90-х років Свердлов повідомив про успішне застосування капілярів, для електрофорезу при секвенування ДНК. Капіляр представляв собою микротрубочка з внутрішнім діаметром 50 мкм, заповнений поліакриламідних гелем. Такий капіляр дозволяв ефективніше розганяти мічені PCR продукти з-за високого значення співвідношення площі поверхні до об'єму трубки. Електрофорез при цьому здійснювався при високій напрузі, що дозволило істотно скоротити час «читання» ланцюга ДНК. Незабаром капілярний електрофорез був також вдосконалено за допомогою використання спеціального полімеру низької в'язкості, здатного заповнювати простір капіляра при відносно низькому тиску (Ruiz-Martinez et al., 1993). Ця властивість наповнювача зіграло ключову роль в повній автоматизації секвенування ДНК. Поліакриламідний гель - це так званий поперечно-зв'язаний полімер (гель, який представляє собою мережу з поздовжніх і поперечних стабілізуючих зв'язків) з високим ступенем в'язкості. Замінити такий полімер уявлялося неможливим, тому зміна капіляра з полімером здійснювалася вручну. Спеціальні полімери, наприклад POP - 4, не мають поперечних стабілізуючих зв'язків, тому їх в'язкість досить низька, що дозволяє автоматично замінювати його після пробігу реакційної проби, не змінюючи капіляра. Крім того, такий полімер зберігає свою структуру при температурі до 60 ° С, що забезпечує високу якість даних секвенування (Zhang et al., 1995).
2. Матеріали і методи
Матеріалом для дослідження послужили 4 зразка осетрових риб з природних популяцій річки Амур (Хабаровський філія ТІНРО-центру).
.1 Отримання геномної ДНК
ДНК отримували з печінки, фіксованою в 80% етанолі. Печінка гомогенизировали в ТЕ-буфері (0.01 М TRIS, 0.5 M EDTA, ph=8.0), екстракцію проводили за стандартною методикою (Маніатіс та ін, 1984) з використанням протеїнази К і подальшої депротеїнізація фенолом і хлороформом, а також переосажденіем ізопропиловим і етиловим спиртами. Фіксовану тканину піддавали триразовою промиванні в 70% спирті, з подальшою двухкратной промиванням у розчині SSC (0.15 M NaCl + 0.015 M цитрат Na) +0.1 М ЕДТА, pH=8.0. Потім тканину гомогенизировали в цьому ж розчині з наступним додаванням 10% SDS до 1%. Екстракцію ДНК з печінки проводили також. Для проведення PCR геномную ДНК розчиняли в ТЕ-буфері і зберігали при +4 ° С.
2.2 PCR-ампліфікація 18S РДНК
Д...
