лідок; максимальна діагностична потужність;
В· чутливість і специфічність, що досягають 100%, висока відтворюваність;
В· стислі (Протягом декількох годин) терміни дослідження;
В· помірна і постійно знижується собівартість (від 100 рублів на одну
В· реакцію).
Показаннями до генодіагностіка ГБМ є:
В· пЂ негативні результати діагностики іншими методами;
В· пЂ використання для діагностики зразків СМР, узятих після антибіотикотерапії або на пізніх стадіях хвороби;
В· пЂ необхідність термінового діагностичного результату;
В· пЂ заміщення дорогих імунологічних методів.
Прямих протипоказань до застосування генодіагностики ГБМ не існує. Однак, з одного боку, ПЛР здатна виявити найменший бактеріальне забруднення тестованого зразка і робочих розчинів, з іншого боку, в ряді біологічних рідин, у тому числі, СМР можлива присутність інгібіторів ПЛР. Тому тільки використання при постановці реакції позитивних і негативних контролів, високе і періодично перевіряють якість всіх використовуваних реагентів, акуратність виконання дослідження дозволяють уникнути як хибнопозитивних, так і помилково негативні результати.
Виділення ДНК
Основне необхідне обладнання та витратні матеріали:
1) настільний бокс з бактерицидною лампою ("Ціклотемп", СП "РТС");
2) термостат для пробірок типу "Еппендорф" на 25-1000С ("Біоком");
3) мікроцентрифуга до 12-16 тис. g. ("Elmi", "Hettish");
4) центрифуга/вортекс ("" Біоком ");
5) набір автоматичних піпеток змінного об'єму (В«БіокомВ»);
6) одноразові наконечники з аерозольним бар'єром для піпеток змінного об'єму, одноразові поліпропіленові загвинчуються або щільно закриваються пробірки на 1,5 мл (В«БіокомВ», В«ХеліконВ»);
7) окремий халат і одноразові рукавички. Аналогічне обладнання та матеріали общелабораторного призначення знадобиться і на наступних етапах.
ДНК з бактеріальної суспензії виділяється стандартними методами лізису/сорбції/відмивання (Наприклад, з використанням наборів "ДНК-сорб", ЦНДІ епідеміології) або фенол-хлороформно екстракції. Концентрації ДНК у пробі при необхідності можна визначити спектрофотометрично при довжині хвилі 260 нм. Число мікроорганізмів, еквівалентних даної концентрації ДНК, розраховується виходячи з приблизного співвідношення: 1 бактеріальна клітина містить 4 фемтограмм ДНК. p> Зразки СМЖ можна використовувати в реакції ампліфікації безпосередньо; перед дослідженням проба (100 мкл СМР, покриті зверху 100 мкл мінерального масла) інкубується в термостаті для мікропробірок 20 хвилин при 99 0 С для руйнування бактерій, після чого центрифугируется при 10000 g протягом 1 хвилини при кімнатній температурі і супернатант відбирається для постановки ПЛР. Концентрацію і чистоту ДНК у подібній пробі можна підвищити, додавши етап виділення шляхом сорбції. При цьому, щоб переконатися, що в кожному зразку СМР виділення ДНК пройшло успішно, у зразок СМР перед виділенням ДНК додається внутрішній контроль - препарат ДНК, наприклад, вірусу гепатиту В (HBV), а також готується додаткова пробірка без СМР, але з HBV, яка представляє собою негативний контроль виділення. Надалі для кожного зразка СМР ставиться реакція на виявлення ДНК HBV, яка має дати позитивні результати.
Аналіз та облік результатів
Продукти ампліфікації виявляються і диференціюються методом електрофорезу в 1.8% агарозному гелі, що містить бромистий етидій, з подальшою візуалізацією гелю при підсвічуванні ультрафіолетовим випромінюванням. Довжина ампліфікованого фрагмента гена 16S РНК Neisseria - 341 пар нуклеотидів, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus-792 п.н., довжина специфічних амплікон N. meningitidis серогрупи А - 349 п.н., групи В - 539 п.н., С-209 п.н.. Фіксацію, збереження та аналіз отриманих зображень гелів зручно проводити за допомогою спеціалізованих систем обробки зображення (Gel-Doc, БіоРад; BioTest, ЦНДІ епідеміології); однак при невеликому обсязі досліджень можлива і безпосередня візуальна оцінка та/або фотографування результатів.
Очікуваний ефект від впровадження методу
Ефективність використання методу складається з кількох компонентів:
перше, ПЛР дозволяє діагностувати у два з половиною рази більше випадків менінгококового менінгіту і в два рази більше випадків пневмококової менінгіту в порівнянні з культивуванням.
За порівнянні з методом ЛА, ПЛР можна виявити в два рази більше випадків менінгококового менінгіту та в 1.4 рази більше випадків пневмококової менінгіту. У разі менінгіту, що викликається гемофільної паличкою типу b, ефективність ПЛР і ЛА приблизно однакові, що ймовірно розмовляє великим накопиченням бактеріального антигену в СМР при даній патології. По-друге, терміни ПЛР-діагностики складають 3-4 години, а мікробі...
