основою для їх назви - антибіотики-іонофори.
Зазвичай біологічні мембрани непроникні для іонів К +. У дослідах з мітохондріями і клітинами Streptococcus faecilis було показано, що в присутності антибіотиків валиномицина або граміцидину С мембрани стають проникними для цих іонів, але не для іонів Na + і Li +. Встановлено, що придушення зростання S. faecilis у присутності валиномицина, граміцидину, нон-актину пов'язане з втратою кліткою іонів К +, яка індукується цими антибіотиками. Крім цього граміцидин С відноситься до антибіотиків ингибиторам окисного фосфорилювання.
Спосіб визначення активності граміцидину С.
Готують бактеріальну суспензію. Стандартний і випробуваний препарати граміцидину С в різних розведеннях, поміщають в кювети люменометра і додають туди IIO 1 мл бактеріальної суспензії. Протягом 20 хв реєструють світіння. У дослідній пробі визначають ступінь падіння люмінесценції у порівнянні зі стандартом. В якості тест-об'єкта використовуються суспензії Photobacterium Keiopnathi, що дозволяє оцінити активність антибіотика за ступенем падіння люмінесценції.
Культуру Photobacterium Keiopnathi вирощують на напівсинтетичній середовищі до досягнення максимальної інтенсивності світіння. Готують бактеріальну, суспензію шляхом центрифугування і ресуспендіроввнія в фосфатно-сольовому бульйоні до концентрації около1? 10 кл/мл. Отриману суспензію зберігають при +4 С до використання (не більше 2-х діб). Для проведення аналізів використовують бактеріальну суспензію, що містить від 1? 10 до 2? 10 кл/мл.
Концентрацію граміцидину визначають наступним чином. Стандартний і випробуваний препарати граміцидину в різних розведеннях поміщають в кювети люменометра" туди ж додають по 1 мл бактеріальної суспензії. Протягом 20 хв реєструють світіння на стрічці самописця від усіх кювет. Потім визначають ступінь падіння люмінесценції в дослідній пробі у порівнянні зі стандартом.
Для отримання вихідного препарату індикаторних бактерій штам Photobacterium Keiopnathi засівають в 100 мл полусінтіческой 4 середовища. Колбу з культурою інкубують при 28 С на гойдалці, реєструючи ріст і розвиток люмінесценції. Після досягнення максимальної інтенсивності світіння клітини відокремлюють від середовища центрифугуванням (5000 g, 10 хв) і суспензіруют в 10 мл 0,1 M фосфатного буфера рН 7,1, що містить 0,5 M NaC1.
Отримана таким чином суспензія містить близько 1? 10 кл/мл і може зберігатися без значної втрати люмінесцентної активності протягом 2 сут при +4 С.
Кількісне визначення граміцидину засноване на порівнянні ступеня пригнічення світіння різними, концентраціями стандартного і обумовленого препаратів.
Вихідну суспензію бактерій розводять у фосфатно-сольовому буфері до 1 кінцевої концентрації 1? 10кл/мл. У кювети наливають по 1 мл бактеріальної суспензії і така кількість стандартного розчину антибіотика, щоб його концентрація в кюветах становила 20 од/мл, 25 од/мл, 30 од/мл. В якості дослідного зразка в кювети з суспензією вносять відоме кількість того ж стандартного розчину граміцидину. Всі проби стандартні у двох, а досвідчені в трьох повторностях поміщають в установку, в якій реєструють люмінесценцію протягом 20 хв на стрічці самописця. При обробці результатів в якості кількісної міри ступеня пригнічення світіння використовують параметри, рівні відношенню світіння після 15 хв контакту бактерій з антибіотиками до його вихідного рівня. Значення цього параметра усереднюють по готовності і заносять в таблицю.
За отриманими значеннями для кожного з експериментів будують калібрувальний графік і по ньому визначають розрахункову концентрацію антибіотика в пробі.
Метод розведень.
Принципом методів розведень є визначення кількості антибіотика, яке повністю пригнічує ріст тест-культури. При цьому розчин аналізованого зразка з невідомим вмістом антибіотика і розчин стандарту з відомим змістом антибіотика розводять в геометричній прогресії живильним середовищем, попередньо засіяної тест-культурою. Після закінчення необхідного часу інкубації визначають максимальне розведення зразка і стандарту, яке ще пригнічує ріст тест-культури. Шляхом порівняння цих розведень обчислюють активність досліджуваного зразка. Внаслідок того що оцінку проводять за якісним ознакою ( росте - не росте ), цей метод не задовольняє першому з перерахованих вище вимог. Разом з тим головною перевагою методів розведень є їх висока чутливість, можливість визначати дуже малі кількості антибіотиків, а в деяких випадках - і короткий час (близько 3:00), необхідне для отримання результатів.
При визначенні вмісту антибіотиків в рідинах тіла методом серійних розведень можна використовувати індикатори, що реагують на зміну рН або окислювально-відновного потенціалу в процесі росту тест-мікроба, наприклад бромкрезоловий червоний, метиленовий синій, тимолова синій, водний синій або феноловий червоний та ін.
