имана плазміда позначена як pSWEET- bgaB ) (ріс.5b). bgaB можна вирізати разом з RBS за допомогою PacI і однією з рестриктаз для полілінкера, і замінити його будь-яким цікавлять геном.
В В
PacI
br clear=ALL>
b
a
MCS
br/>
Рис. 5. a) Структура плазміди pSWEET- bga B. AmyE - сайти через які йде рекомбінація та інтеграція з хромосомою; Cm і Amp - гени резистентності до хлорамфеніколу і ампіциліну, відповідно; ori - область реплікації в E. coli; Pac I, сайт рестрикції; b) ксілозний система експресії великим планом. Показані: ген ксілозний репрессора xylR ; промотори генів xylR ( PxylR ) і xylA ( PxylA ) І оператор xylO ; урізаний xylA (перші 58 п.н. + TAA), що включає в себе оптимізований CRE; сайт зв'язування рибосоми гена tagD (RBS); ген bgaB , що кодує термостабільну b-галактозидазу.
Дана система експресії (далі система xyl ) була зрівняна з широко застосовуваної системою експресії spac , заснованої на застосуванні лактозного репрессора та оператора E. coli для контролю експресії в B. subtilis . Для цього був використаний вектор pSPAC- bgaB, створений шляхом вставки bgaB в плазміду pDR67 (Weickert, Chambliss, 1990), що містить spac систему для інтеграції в сайт amyE . Для обох систем експресії сайти зв'язування з рибосомою і навколишні генетичні елементи були однакові. Досліди показали, що
1) для системи xyl характерна значно більш висока різниця між рівнем синтезу продукту при індукції і при репресії (експресія при індукції в 279 разів вище, ніж при репресії; для spac системи - в 16 разів), 2) рівень експресії при індукції в 16 разів вище, ніж у spac системи, 3) в відсутність індуктора рівень експресії нижче, ніж у spac системи; 4) система xyl проявляє чутливість до більшого діапазону концентрацій індуктора. p> Була протестована здатність системи xyl забезпечувати ксилозою-залежну комплементації. Була проведена спроба комплементіровать термочутливі мутанти ( tag- 12) за tagD гену , ...
