ють десорбцію. В окремих випадках вдаються до афінної елюції розчином ліганду або його аналога. Цей прийом, заснований верб конкуренції за зв'язування білка між приєднаним до матриці і розчиненим лігандами, дуже специфічний і ефективний, але дорогий.
Як приклад розглянемо застосування ціклопептідного антибіотика - граміцидину S - в якості ліганда при аффинной хроматографії протеолітичних ферментів. Він містить ряд гідрофобних амінокислот, відповідних специфічності багатьох протеїназ, і два залишку орнитина, Оґ-аміногрупи яких дозволяють легко приєднати ціклопептід до активованої бромцианом сефарозе або іншим матрицям:
В
Залишок орнитина, аминогруппа, якого приєднана до активованої бромцианом сефарозе.
Граміцидин S пов'язує протеїнази різних класів, проте він стійкий до їх дії і не піддається гідролізу, мабуть, через присутності в структурі залишків D-фенілаланіну, проліну, а також з-зa особливостей конформації ціклопептіда. Отже, грамицидин S є природним аналогом субстратів протеназ і добре підходить для ролі лігаіда широкої специфічності. Так, при пропущенні через колонку з грамицидин-5-сефарозой складної суміші речовин, що містяться в культуральній рідини одного з штамів бактерії Bacillus subtilis, сорбент пов'язує тільки металлопротеінази , яку вдається повністю звільнити від домішок і отримати практично чистий білок. p> Ще ефективніше сорбенти, що містять такі ліганди, які взаємодіють не тільки із зоною зв'язування, але і з каталітичним центром ферменту . Наприклад, похідні бензілянтаріой кислоти виявилися хорошими лігандами для виділення карбоксипептидази - ферментів, отщепляют амінокислоти від карбоксильного кінця пептидного ланцюга. Подібність лігандів з субстратами карбоксипептидази на перший погляд невелика, однак виявляється, що група
HООC - здатна виступати в якості своєрідного аналога пептидного зв'язку:
В В
В результаті-карбоксильна група бензілянтарной кислоти взаємодіє з каталітичним центром ферменту, а бічна бензильну група і ошарбоксіл - з компонентами зони зв'язування субстрату. Утворений комплекс ліганда, зазвичай приєднуваного до матриці через аміногрупу, введену в паpаположеніе бензольного кільця, пов'язує фермент вельми міцно.
Широко використовують своєрідний варіант афінної хроматографії, заснований на застосуванні як лігандів синтетичних барвників антрахінонового ряду , наприклад цібакрона блакитного;
В
Плоска структура, утворена трьома конденсований і ароматичними кільцями заміщеного антрахінону, до якого в положенні 1 приєднані заміщений анілін і триазинове цикл, здатна вибірково взаємодіяти з цілою низкою білків. Ліганд зв'язується, мабуть, під западинах, які нерідкі на поверхні білків, особливо в активних центрах ферментів. Висловлювалися припущення, що антрахінонів разом з приєднаними ядрами аніліну і триазина утворюють структуру, стерично близьку природним лигандам, наприклад таким коферментам, як NAD, і імітують властивий останнім спосіб зв'язування з білками. Зважаючи на це сорбенти, що містять цібакрон блакитний і деякі інші фарбники антрахінону, особливо рекомендуються для афінної хроматографії білків, що містять NAD чи інші з'єднання нуклеотидної природи.
Немає необхідності, щоб нуклеотид або схоже за будовою з'єднання було схоже на субстрат - воно може імітувати ефектор, регулюючий активність ферменту. Так, наприклад, хороші результати дає хроматографія на антрахінонових барвниках аспартаткарбомілази, де нуклеотиди виступають як аллостерічеськіє ефектори. p> Втім, коло білків, що пов'язуються цими сорбентами, значно ширше і включає, наприклад, сироватковий альбумін. Останній легко приєднує різні ліганди, у тому числі деякі лікарські препарати і триптофан, який можна (з великими застереженнями) вважати нагадує конденсовані кільця антрахіноіа. Структура ліганда-заміщеного антрахінону - не байдужа, тому, використовуючи різні барвники, вдається отримати серію сорбентів, не однаково зв'язують різні білки. br/>
іммуносорбція
В
До числа найбільш специфічних належить взаємодія білків з антитілами - імуноглобулінами. Це властивість з успіхом використовують для створення біоспецифічного сорбентів, в яких роль ліганду виконують специфічні щодо виділяється білка імуноглобуліни. Факс застосування такого роду сорбентів відбуваються приблизно так само, як і в звичайній афінної хроматографії, відрізняючись лише деякими особливостями. По-перше, приєднання імуноглобуліну G до матриці необхідно проводити в щадних умовах. Встановлення між молекулою антитіла і носієм безлічі ковалентних зв'язків (яке може статися, якщо домагатися підвищення ємності сорбенту) сприяє денатурації білка і може, отже, призвести до втрати специфічності антитіла.
друге, використання звичайних, поліклональних , антитіл, які являють собою дуже складну суміш моле...
