имірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної на ФЕК або СФ при 630 нм (світлофільтр червоний). p align="justify"> Серію розчинів для побудови калібрувального графіка готують згідно з таблицею.
№ пробіркі4-аминофенол, млВода, млNа2СО3, млФенол, млСодержаніе 4-амінофенолу в пробі, (Контроль)
Потім пробірки ставлять на 30 хв у водяну баню при 37? С. Вимірюють екстинкцію проб проти контролю, як описано вище, і будують калібрувальний графік. p align="justify"> Розрахунок проводять за формулою
АV
х = ---,
20m
де х - гідроксилазних активність нмоль/(хв? мг білка);
А - вміст 4-амінофенолу в пробі, знайдена за калібрувальним графіком, нмоль; - обсяг проби, рівний 1,71 мл;
- час інкубації, хв; - вміст білка в пробі, мг.
Практичне значення роботи. Для вивчення функції мікросомальної ланцюга окислення печінки в нормі і особливо при патологічних станах використовують різні методичні підходи. Зокрема, дослідження проводять з різними субстратами, перетворення яких відбувається на цитохроме Р450. При взаємодії з цитохромом Р450 різні субстрати дають неоднакові спектри поглинання. За цією ознакою їх умовно ділять на субстрати I типу (до них відносяться, наприклад, амідопірин, Бензфетамін, етілморфін тощо) і II типу (анілін), що пов'язано, можливо, з деякими відмінностями в механізмі гідроксилювання даних сполук.
Швидкість реакцій гідроксилювання змінюється при дії багатьох зовнішніх факторів (радіації, гіпероксії, гіпоксії, інтоксикації чотирьоххлористим вуглецем і т.д.), під впливом ряду регуляторів (вітамінів, гормонів). Для отримання більш повної інформації про діяльність гідроксилазних активності мікросом печінки при дії багатьох факторів і при патології використовують різні ксенобіотики - субстрати цитохрому Р450. p align="justify"> Робота 103. Метод оцінки активності монооксигеназ ендоплазматичної мережі клітин печінки з виділення метаболітів амідопірину з сечею по Т.А. Попову і О.Д. Леоненко
Метаболізм амідопірину здійснюється за допомогою ферментативних реакцій окислення і кон'югації. Перша з них (N-деметилювання) каталізується монооксигеназної ферментної системою ендоплазматичної мережі печінки за рівнянням
В
Далі 4-аміноантипірину за участю відповідної N-ацетилтрансферази і ацетил-КоА піддається ацетилювання:
В
Реактиви. Фенол перекристалізований, 0,02%-ний розчин; аміачний буфер з рН 10,5-10,6 (20 г хлориду амонію розчиняють в 100 мл 25%-ного розчину аміаку); трихлороцтової кислота, 12,5%-ний розчин; соляна кислота, 36%-ва; гексаціаноферрат (III) калію, 1%-ний розчин; 4-аміноантипірину, свіжоприготований стандартний розчин 1 мг/мл для побудови калібрувального графіка.
Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,2, 1, 2 і 5 мл; пробірки, обгорнуті фольгою; воронки з паперовими фільтрами; воронки зі скляним дрібнопористі фільтром; водяна баня; ФЕК або спектрофотометр. p> Матеріал. Сеча, яка містить метаболіти амідопірину. Для отримання сечі білим щурам внутрішньочеревно вводять розчин амідопірину з розрахунку 20 мг на 1 кг маси тіла, потім відкидають їх у скляні видільні воронки і збирають сечу в мірні циліндри протягом 12 або 24 ч. Перед дослідженням сечу фільтрують через паперові фільтри.
Метод заснований на здатності 4-аміноантипірину, є метаболітом амідопірину, при взаємодії із фенолом в лужному середовищі і в присутності гексаціаноферрата (III) калію утворювати з'єднання типу індофенолу, що має рожеве забарвлення.
Хід визначення. У дві пробірки вносять по 1,5 мл профільтрованої сечі. У першу (для визначення вільного 4-аміноантипірину) доливають 0,3 мл аміачного буфера, а в другу (для визначення суми метаболітів, тобто 4-аміноантипірину і N-ацетил-4-аміноантипірину) 0,3 мл соляної кислоти. Перемішують проби, обережно струшуючи пробірки. p align="justify"> Вміст першої пробірки через 15 хв фільтрують через паперовий фільтр; другу пробірку закривають пробкою, оберненої фольгою, і поміщають на 15 хв у киплячу водяну баню, після чого відразу охолоджують пробу у воді з льодом до кімнатної температури. Охолоджений гідролізат фільтрують через мілкопористий скляний фільтр в іншу пробірку. p align="justify"> Відбирають з першої проби 0,6 мл фільтрату в чисту пробірку і додають послідовно 0,5 мл розчину трихлороцтової кислоти, 2 мл розчину фенолу і 0,1 мл розчину гексаціаноферрата (III) калію. Вміст перемішують і через 10 хв (але з пізніше ніж через годину) вимірюють екстинкцію дослідної проби на ФЕК (світлофільтр зелений) або на спектрофотометрі при 510 нм в кюветі з товщиною шару 1 см проти контрольної, яка містить всі компоненти, крім фенолу, який замінюється 2 мл дистильованої води. Отримана екстинкція (Е1)...
