я S.aureus в концентрації 2 Г— 107 кл/мл. Потім суспензію клітин з бактеріями і без них розноситься по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-ямкового планшета по три на кожен зразок. Після інкубації при 37 В° С протягом 45 хв клітинний моношар тричі відмивається теплим розчином Хенкса без фенолового червоного від розчину НСТ і непоглощенная бактерій і висушується. Моношар клітин фіксується в парах формаліну протягом 15 хв. Потім клітини руйнують шляхом додавання в лунки попередньо розігрітого до 83 В° С діметілсульфаміда (DMSO, виробництво В«ICNВ») по 50 мкл. Оптична щільність отриманих розчинів вимірюється на спектрофотометрі "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") При довжині хвилі 540 нм [46]. p>) Тести на фіксованих зразках
Визначення активності ферментів проводиться на фіксованих зразках, які готуються наступним чином. Виділена клітинна суспензія з концентрацією 2 Г— 106 кл/мл ділиться на дві частини і в половину з проб вноситься S.aureus в концентрації 2 Г— 107 кл/мл. Потім суспензію клітин з бактеріями і без них розноситься по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-ямкового планшета по три на кожен зразок. Після інкубації при 37 В° С протягом 45 хв клітинний моношар тричі відмивається теплим розчином Хенкса без фенолового червоного від непоглощенная бактерій і висушується. Потім фіксують в парах формаліну протягом 15 хв, після чого досліджують ферментативну активність клітин [49]. p>) Визначення активності мієлопероксидази
А) Твердофазний метод
Свіжоприготований субстратний розчин (до 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) додається 4 мг o-phenylenediamine (ICN) і 500 мкл 0,33% перекису водню) по 100 мкл вноситься в лунки планшета, містять адгезіроваться на пластик і фіксовані клітини. Планшет інкубується при кімнатній температурі протягом 10 хв, потім реакція зупиняється додаванням 10% розчину сірчаної кислоти по 100 мкл на лунку. Оптична щільність розчину визначається на спектрофотометрі "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") При довжині хвилі 492 нм) [38]. p align="justify"> Б) Цитохимические методи
Пероксидаза є ферментом - лізосомальної каталазой, що каталізує у присутності перекису водню окислення різних субстратів. При окисленні ортотолидину або бензидина, що використовуються в реакціях, утворюються інтенсивно забарвлені сполуки, в тому випадку, якщо в клітці присутній пероксидаза, при взаємодії з якою перекис водню руйнується з виділенням кисню, який і окисляє орто-толідін або бензидин, переводячи їх у забарвлені сполуки (малюнок 1.3). У цитохімічних реакціях активність ферменту визначається по окисленню хромогенів (бензидина, про-діанізідіна та інших) за методом Грехема-Кнолла або його модифікацій [2, 45]. br/>В
Малюнок 1.3 - Реакція на миелопероксидазу
Метод Грехема-Кнолла. У присутності мієлопероксидази бензидин окислюється перекисом водню в коричневий оксібензідін. p align="justify"> В· Свіжі ...
