остей характеристик порівнюваних вибірок складає 95%.
3.2.3 Метод рідинної імуноцитохімії
Всі гастробіоптатов МОР, отримані при виконанні фіброезофагогастродуоденоскопіі з прицільною багаторазової біопсією, поміщалися в одну пробірку із стерильним фосфатним буфером. Пробірку з вмістом інтенсивно струшували кілька разів, а гастробіоптатов виймали, гомогенизировали і поміщали в іншу пробірку з 2,5 мл свіжого буфера. Отриману суспензію піддавали центрифугированию на роторної центрифузі протягом 10 хвилин зі швидкістю 1600 об / хвилину, потім з надосадової рідини готували концентровані моношарова цитологічні препарати з використанням цітоцентріфугі CytoFuge2. Для цього надосадову рідину в обсязі 200 мкл поміщали у фільтр-концентратор і центрифугували протягом 10 на швидкості 1600 об / хвилину. Отримані моношарова цитологічні препарати фіксували сумішшю спирт: ацетон у співвідношенні 1:1 і потім фарбували іммуноцітохіміческіе методом в авидин-биотиновой варіанті, який включав такі етапи:
· промивку в двох змінах трис-NаСl - буфера по 5 хвилин;
· блокування ендогенної пероксидази в 3% розчині перекису водню на метанолі в холодильнику при + 4? С протягом 30 хвилин;
· промивку в двох змінах трис-NaCL - буфера по 5 хвилин,
· інкубацію з нормальною сироваткою - 30 хвилин;
· інкубацію з першими кролячими поліклональними антитілами до антигенів клітинної стінки H.pylori (DAKO) протягом однієї години при кімнатній температурі;
· промивку в двох змінах трис-NaCL - буфера по 5 хвилин;
· інкубацію з другими антікролічьмі мишачими антитілами (DAKO) 30 хвилин у вологій камері;
· промивку в двох змінах трис-NaCL - буфера по 5 хвилин;
· інкубацію з авидин-биотиновой (DAKO) комплексом 30 хвилин;
· промивку в двох змінах трис-NaCL - буфера по 5 хвилин;
· прояв пероксидази діамінобензідіном (DAKO) (під контролем мікроскопа);
· промивку дистильованої воді 5 хвилин;
· докрашіваніе гематоксиліном Майера 1 хвилину.
.3 Результати досліджень, їх аналіз та обговорення
.3.1 Результати рідинної імуноцитохімії
Технологією рідинної цитології було оброблено та пофарбовано іммуноцітохіміческіе методом 8 гастробіоптатов з антрального відділу шлунка. З огляду на те, що у нас не стояло завданням кількісне визначення НР в МОР пацієнта, а лише встановлення достовірності присутності деякої кількості кокова форм, все гастробіоптатов оброблялися одночасно. У результаті було отримано 24 препаратів: 16 з гомогенізованих гастробіоптатов і 8 з змиву з гастробіоптатов. У всіх препаратах були виявлені бактеріальні клітини, що мають специфічне для H.pylori фарбування.
Після проведеної іммуноцітохіміческіе реакції в препаратах, приготовлених з гомогенізованих гастробіоптатов, бактеріальні клітини H.pylori (спіралеподібні і кокова форми) забарвлювалися діамінобензідіном в кольори від темно-коричневого до насиченого чорного.
Розміри спіралеподібних...
