малим (* 8), а потім під великим (* 40) збільшенням сухої системи мікроскопа. Елементи гриба вимірюють за допомогою окулярного мікрометра, значення поділу якого попередньо визначають об'єкт-мікрометром.
3.2.3 Мікрокультури готують для дослідження мікроморфології гриба з метою В«го точної ідентифікації
На центр покривного скла наносять краплю рідкого середовища, що містить грибні елементи, і встановлюють його краплею вниз на змащене вазеліном кільце Вантігема або предметне скло з лункою. Для запобігання висихання на дно вносять краплю води. Можна приготувати мікрокультури в агарових блоках. Для цього з агару вирізують квадрати розміром 10x10 мм, висотою 2 мм і переносять їх на предметне скло. Культуру засівають посередині кожного ребра агарового квадрата, накривають його покривним склом і проміжок між покривним і предметним склом заповнюють попередньо розплавленим парафіном для запобігання висихання. Мікрокультури інкубують у вологій камері (чашка Петрі або ексикатор з зволоженою ватою).
При мікроскопічної характеристиці культур слід враховувати септірованность міцелію, наявність, характер і спосіб прикріплення макроконідій і мікроконідій, а також структуру міцелію і його утворень - спіралей, гребішковою гифов, фавіче-ських канделябрів. Наявність і характер хламідоспор не мають вирішального діагностичного значення.
3.2.4 Біохімічні диференційно-діагностичні тести
При неможливості ідентифікувати штами, грунтуючись тільки на їх морфологічних особливостях, застосовують тести для визначення деяких проявів метаболічної активності грибів. Для лабораторної практики розроблені методи визначення поживних потреб і методи визначення ферментативної активності дерматофітів.
Визначення потреби в джерелах живлення і вітамінах.
Основну мінімальну середу (NH4NO3 1,5 г, глюкоза 40 г; MgS04 • 7НгО 0,5 г; КН2РС> 1 Квітня г; агар Діфко 20 г; дистильована вода до 1000 мл) розчиняють при нагріванні і автоклавують при 0,5 атм 15 хв. Вітаміни (тіамін 1 мг, i-інозит 250 мг, L-гістидин 150 мг, нікотинова кислота 10 мг) розчиняють в 100 мл дистильованої води кожен, автоклавують при 0,5 атм 15 хв і зберігають у холодильнику. Перед досвідом 2 мл того чи іншого вітаміну додають до 100 мл остигає основного середовища. Для визначення здатності асимілювати вуглеводи їх вносять в основну середу замість глюкози до кінцевої концентрації 1%. Джерела азотистого харчування вносять у середу замість NH4NO3. Контролем служать посіви на основну та збагачену середу.
кератінолітіческой активність (Тест перфорації волосся).
А) Дрібно роздроблену очищену грунт стерилізують в автоклаві 3 дні поспіль по 1 годині при 1 атм. і поміщають в чашки Петрі рівним шаром у 3-4 мм. На поверхні грунту рівномірно і не густо розподіляють нарізані на короткі фрагменти (15-20 мм) дитячі волосся, простерилізовані в автоклаві 2 дні підряд по 20 хв при 1 атм. На поверхню грунтово-волосяний середовища наносять суспензію досліджуваної культури в 1-2 мл дистильованої води. Посіви інкубують 4 тижні при 22-27 В° з щотижневим зволоженням середовища стерильною дистильованою водою. Наявність органів-перфораторів або інших форм кератінолі-зиса реєструють шляхом щотижневої мікроскопії волосся, на яких відбувається розвиток культури гриба.
Б) Смужку фільтрувального паперу поміщають на дно стерильної чашки Петрі і покривають стерильною дистильованою водою. Вносять нарізані стерилізовані волосся, 5-6 крапель 1% дріжджового екстракту і зваж досліджуваної культури. Інкубують при 25 В° 4 тижні. Щотижня мікроскопіруют волосся на наявність конічних органів - перфораторів волосяного стрижня. Даний метод застосовують для диференціації Т. equinum, T. raentagrophytes, T. rubrum, a також для отримання досконалих форм дерматофітів з грунту.
Диференціальна Середа з молоком, глюкозою і бромкрезол - пурпуровим (ВСР + CCG + 0,5% дріжджового екстракту) дозволяє диференціювати види дерматофітів за двома параметрами: за-щелачіваніе середовища (блакитна -> пурпурна) і зона просвітління навколо колоній за рахунок гідролізу молока.
Гемолітичну активність визначають на середовищі Сабуро рН 6,5 з фосфатним буфером і з 5% дефібринованої баранячої крові. Еритроцити вносять у остигаючий агар, і середу розливають по чашках досить товстим шаром. Після посіву досліджуваних культур чашки інкубують 2 тижні при 27 В°. Про гемолітичної здібності судять по утворення навколо колоній зони просвітління внаслідок розчинення еритроцитів. Зеленувате забарвлення цієї зони розцінюють як альфа-гемоліз, наявність прозорої і безбарвною зони-як бета - гемоліз. Контролем служать незасіяні чашки з 5% кро-год вяним агаром. Тест може служити для диференціації Т. rubrum і Т. mentagrophytes, а також Т. tonsurans і Т. soudanense. p> Визначення уреазний активності (здатності розщеплювати сечовину) виробляють на середовищі Хрістенсен з сечовиною. Склад середовища: пептон 1 г, NaCl...
