в отриманні генів за допомогою методів зворотної транскрипції служить виділення і очищення геномних РНК і мРНК. Геномні РНК виділяють головним чином з очищених віріонів, а мРНК - з інфікованих клітин. Для виділення мРНК з інфікованих клітин використовують різні способи. В одному з варіантів виділення мРНК з інфікованих клітин проводять безпосередньо з ціалізуватися клітин (лізис здійснюють у денатуруючих середовищах з метою запобігання руйнівної дії нуклеаз на мРНК) з подальшою екстракцією фенолом і хлороформом або центріфігурірованіем лізата через подушку 5,7 M СsCl (для звільнення від клітинних ДНК ) і заключної афінної хроматографії на оліго (dТ) - целюлозі (полі (У) - сефарозе). Виділення мРНК можна проводити і з очищених полірібосом інфікованих клітин. p align="justify"> У разі необхідності отримання специфічних мРНК, що кодують структурні білки збудника, використовують наступний спосіб. Інфіковані вірусом клітини руйнують механічним шляхом або хімічними методами (використання неіонних детергентів). Клітинний лізат звільняють від ядер і мітохондрій методом диференціального центрифугування і піддають хроматографії на антитільної сорбенті. При цій процедурі з антитілами, специфічними до певного структурного білку збудника, зв'язуються полісоми, здійснюють синтез цього білка. Також може бути використаний метод непрямої іммунопреціпітаціі полісом, при якому комплекс антитіло - полісома преципітує з розчину додаванням другого антитіла, специфічного до першого. В якості другого антитіла найчастіше беруть фіксовані формаліном клітини Staphilococcus aureus, на поверхні яких знаходиться так званий білок А, що має спорідненість до Fc-фрагментами Ig. З полісом, отриманих одним з описаних способів, далі вже виділяють мРНК. p align="justify"> Інший шлях виділення індивідуальних мРНК базується на властивості мРНК взаємодіяти з комплементарними ДНК, пов'язаними з твердим носієм (целюлоза, сефароза, нітроцелюлозні фільтри). Цей метод відбору та очищення специфічних мРНК є найефективнішим. Однак його застосування можливе лише за наявності відповідних комплементарних ДНК. p align="justify"> Отримання препарату очищеної мРНК дозволяє перейти до робіт з синтезу гена за допомогою зворотної транскрипції, яку здійснюють за допомогою ревертази AMV у спеціально підібраних умовах. У процесі зворотної транскрипції матрицею служить мРНК, а затравкою оліго (dT 12-18 ) (для мРНК, що мають полі (А) - тракт) або хімічно синтезований олигонуклеотид, комплементарний 3'-кінця мРНК. Після синтезу на мРНК комплементарної ланцюга ДНК і руйнування РНК (частіше використовується обробка лугом) здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. У цій реакції матрицею служить перший ланцюг ДНК. Реакція може каталізувати як ревертазой, так і ДНК-полімеразою.
Після отримання двухцепочечной кДНК слід стадія отримання гена, що полягає в гідролізі одноланцюжкові ділянки ДНК, що з'є...
