рами. Об'єм препарату, який вноситься на колонку, може становити 20-25% від повного обсягу колонки. Очищення відбувається швидко (приблизно за 1 годину). Розбавлення очищеного препарату виявляється незначним (10-20%), так як він виходить з колонки не В«ПікомВ», а протяжної В«майданчикомВ», розширення якої йде тільки за рахунок дифузії на її передньому і задньому фронті. При роботі з мікрокількостей можна в Як колонки використовувати циліндрик пластмасового шприца на 1 мл.
Поклавши на дно шматочок скляної вати, його щільно набивають гранулами, залишивши зверху вільні 0,1 мл для заповнення їх сумішшю ДНК і її попередників у розчині буфера.
елюція - центрифугуванням. Під циліндрик підставляють пробірку від микроцентрифуги і всі разом встановлюють у пробірку Бакет-ротора. Вихідна з циліндрика рідина в обсязі того ж 0,1 мл містить чисту ДНК - попередники залишаються в гранулах.
2. Фракціонування (розділення) суміші макромолекул не надто значно розрізняються за своїми розмірами. Наприклад, різних білків. Тут слід використовувати довгі (1-1,5 м) колонки, діаметром не більше 1 см і завантажувати їх обсягом вихідного препарату, що становить не більше 1-2% від обсягу колонки. Якщо суміш містить 2-3 компонента, то їх нерідко вдається розділити повністю - вони виходять у вигляді досить широких, але не перекриваються один з одним піків.
Якщо ж суміш складається з декількох компонентів, то на хороше їх поділ методом гель-фільтрації розраховувати не доводиться. Адже всі ці компоненти, хоча і з різною швидкістю, рухаються по колонці одночасно. (Інша справа істинна хроматографія. Там на перший план виступає сорбція компонентів на модифікованому матеріалі гранул і кожен з них залишається сорбованих всередині гранул до тих пір, поки елюент В«ПримусовоВ» не отримає його звідти.) p> Проте, і в цьому випадку гель-фільтрацію можна використовувати для очищення одного з компонентів складної суміші, якщо примиритися з його досить значними втратами. З цією метою суміш, наприклад білків, розганяють за обсягом елюенту так, що цікавить експериментатора білок виявляється десь в середині послідовності НЕ повністю розділилися піків різних білків. (Для цього треба підібрати розмір пір використовуються гранул.) Якщо потрібний білок піддається ідентифікації, наприклад по ферментативної активності, яка зважаючи м'якості способу фракціонування цілком може зберегтися, то можна відібрати вузьку область елюенту, прилеглу до вершини піку цього білка. Таким чином, хоча й зі значними втратами, іноді вдається отримати практично чистий білок.
Основні матеріали гранул (В«МатрицьВ») для гель-фільтрації
Саме тут доречно познайомитися з основними матеріалами, з яких різні фірми виготовляють матриці для гель-фільтрації, оскільки ті ж матеріали після відповідної хімічної модифікації використовуються в інших видах хроматографії.
1. Гелі на основі декстрану-В«сефадексеВ» В»
Найчастіш...
