мл 0,5-кратного буфера ТБЕ. Агарозу нагрівають в мікрохвильовій печі до повного розплавлення. p> - 20 мл концентрованого буфера ТБЕ розбавляють 480 мкл дистильованої води, отримуючи буфер для електрофорезу.
Обладнання
- прилад для вертикального електрофорезу;
- джерело живлення (джерело постійного струму);
- трансілюмінатор;
- фото-або відеокамера з фільтрами для зйомки в УФ;
- автоматичні піпетки та наконечники.
Заходи обережності і правила роботи при постановці електрофорезу
Реагент бромистий етидій є сильним мутагеном, тому всі маніпуляції проводять з використанням рукавичок. Реагенти, що містять бромистий етидій, перед утилізацією слід піддавати спеціальній обробці.
Знешкодження реагентів
Відпрацьовані гелі та буфер з камери поміщають у пластикову ємність на 5 л з щільно загвинчується кришкою. Додають 1 об'єм 0,5 M розчину калію перманганату і 1 об'єм 2,5 M соляної кислоти. Акуратно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 4-6 ч. Потім додають 1 об'єм 2,5 M натрію гідроксиду, акуратно перемішують. Скидають нейтралізовані реактиви в каналізацію. p> Постановка
- у спеціальну ванночку з гребінками вносять розплавлений гель і дають охолонути у протягом півгодини;
- після застигання агарози гребінки акуратно дістають, намагаючись не пошкодити утворилися лунки, гель змочують в буфері ТБЕ і поміщають на спеціальну планшету;
- вносять 5 підготовленої проби в луночки гелю;
- гель поміщають у ванночку для електрофорезу і підключають до джерела струму.
Облік результатів
Облік результатів проводять візуально за допомогою трансілюмінатора. При цьому агарозном гель дістають з кювети і поміщають на скло трансілюмінатора. Продукти реакції ампліфікації виглядають у вигляді світних смуг, які спостерігаються візуально в УФ-світлі трансіллямінатора. Результати фіксують за допомогою фотографування або відеозйомки гелю при використанні УФ-фільтрів (рис. 2).
Малюнок 2. Фотографія гелю з продуктами реакції ампліфікації в УФ-світлі трансіллімінатора
В
ВИСНОВОК
ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів і в наукових експериментах.
ПЛР використовують для порівняння так званих "генетичних відбитків пальців ". Необхідний зразок генетичного матеріалу з місця злочину - кров, слина, сперма, волосся і т. п. Його порівнюють з генетичним матеріалом підозрюваного. Достатньо зовсім малої кількості ДНК, теоретично - однієї копії. ДНК розщеплюють на фрагменти, потім амплифицируют за допомогою ПЛР. Фрагменти розділяють з допомогою гельелектрофореза. Отриману картину розташування смуг ДНК і називають генетичним відбитком пальців (genetic fingerprint).
ПЛР дає можливість істотно прискорити і полегшити діагностику спадкових і вірусних захворювань. Потрібний ген амплифицируют за допомогою ПЛР з використанням відповідних праймерів, а потім секвеніруют для визначення мутацій. Вірусні інфекції можна виявляти відразу після зараження, за тижні або місяці до того, як проявляться симптоми захворювання.
У наш час ПЛР є одним з найбільш високоточних методів, який використовується в багатьох галузях науки і при проведенні аналізів. Він є великим проривом в галузі молекулярної генетики. br/>
