ю полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів-Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші. p> В· Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
В· Іони Mg 2 + , необхідні для роботи полімерази. p> В· Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину. Містить солі, бичачий сироватковий альбумін. p> Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококиплячих масло, наприклад, вазелінове. Якщо використовується ампліфікатор з підігріває кришкою, цього робити не потрібно.
Праймери
Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею і праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18-30 підстав. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів двуцепочечной матриці, обрамляючи початок і кінець ампліфіціруемого ділянки.
Після гібридизації матриці з праймером (відпал), останній служить запалом для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюжка матриці.
Ампліфікатор
ПЛР проводять у ампліфікаторі - приладі, що забезпечує періодичне охолодження і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 В° C. Сучасні ампліфікатори дозволяють задавати складні програми, в тому числі з можливістю "гарячого старту", Touchdown ПЛР (див. нижче) і подальшого зберігання ампліфікованих молекул при 4 В° C. Для ПЛР у реальному часу випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичною кришкою і відділенням для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх в автоматизовані системи.
4. Хід реакції
Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (рис. 1).
Денатурація
Двухцепочечную ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 В° C (або до 98 В° C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв., Щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попереднє прогрівання реакційної суміші в протягом 2-5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів. Такий прийом називається гарячим стартом, він дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.
Відпал
Коли ланцюга розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатись із одноцепочечной матрицею. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається на 4-5 В° С нижче їх температури плавлення. Час стадії - 0,5-2 хв. Неправильний вибір температури відпалу приводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при завищеною температурі), або до зв'язування в невірному місці і появі неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).
Елонгація
ДНК-полімераза реплицирует матричну ланцюг, використовуючи праймер в якості затравки. Це - стадія елонгації. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3'-кінця праймера, який зв'язався з матрицею, і рухається уздовж матриці. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72 В° C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини ампліфіціруемого фрагмента. Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюгові фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв. p> Кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) теоретично зростає пропорційно 2 n , де n - число циклів реакції. Насправді ефективність кожного циклу може бути менше 100%, тому в дійсності P ~ (1 + E) n , де P - кількість продукту, Е - середня ефективність циклу.
Число "довгих" копій ДНК теж зростає, але лінійно, тому в продуктах реакції домінує специфічний фрагмент.
Зростання необхідного продукту в геометричній прогресії обмежений кількістю реагентів, присутністю інгібіторів, освітою побічних продуктів. На останніх циклах реакції зростання сповільнюється, це називають "ефектом плато ".
Рис. 1. Схематичне зображення першого циклу ПЛР. (1) Денатурація. (2) Відпал. (3) Елонгація. (4) Закінчено перший цикл. <В
5. Аналіз ПЦР-ампліфікованої ДНК
Для аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК використовують різні методи, найбільш простим з яких є гель-електрофорез.
Матеріали
- агароза;
- 0,5-кратний буфер для приготування агарозного гелю;
- ТБЕ-буфер для електрофорезу. p> Підготовка реагентів
- У колбу об'ємом 1 літр поміщають 1,5 г агарози, додають 150 ...
