илази або 1,2-дегідрогенази;
) отриманням мутантних штамів, не здатних здійснювати певні стадії розщеплення самого стероїдного ядра.
Ці три способи, а іноді і їх комбінації в поєднанні з оптимальними умовами режиму ферментації дозволили отримати з ряду стеринів великий спектр проміжних сполук, що застосовуються для хімічного синтезу високоактивних стероїдних препаратів.
3. Методи проведення процесів мікробіологічних трансформацій
Незважаючи на різноманітність біотрансформацій стероїдів, методи проведення мікробіологічних реакцій досить одноманітні. При пошукових роботах, де не потрібно чи ні можливості застосовувати великі кількості речовини, обмежуються проведенням реакції в колбах на гойдалках, завантаження стероїду в колбу становить 100 - 200 мг. Для завантажень порядку 1 - 2 г стероїду застосовують скляні ферментери. У промисловості і на досвідчених установках застосовують сталеві апарати, обладнані аеруючими і перемішуючими пристроями.
Зібраний скляний ферментер стерилізують і завантажують стерильною живильним середовищем із заздалегідь внесеним до неї в асептичних умовах трансформирующей культурою. Особливу увагу приділяють дотриманню асептики у всіх операціях. Стерилізацію в залежності від об'єкта здійснюють автоклавуванням живильного середовища при 110-120 ° С в боксах, освітлюваних бактерицидними лампами. Операції по завантаженню, відбору проб проводять у полум'ї газового пальника. Завантаження живильне середовище в ферментер, як правило, здійснюється передавлювання стерильним стисненим повітрям. Час росту культури мікроорганізму-трансформатора визначається появою максимальної трансформирующей активності і може коливатися від декількох годин для одних культур до декількох діб для інших. Для багатьох культур-трансформаторів характерна максимальна трансформуюча активність в період зниження питомої швидкості росту культури.
Розчинність стеринів у воді дуже низька. В даний час стерини, призначені для окислення, у невеликій концентрації (порядку 1 г/л) вносять розчиненими в малотоксичних, смешивающемся з водою розчиннику (ацетоні, спирті, диметилформаміді). При більш високих концентраціях стеринів (вище 1 г/л) їх вносять в середовище у вигляді мелкоізмельченной пудри; для цього кристали стерину розтирають в спеціальній апаратурі або руйнують ультразвуком.
Другий спосіб внесення стеринів для біотрансформації полягає в тому, що стерин, наприклад, ситостерин, розчиняють у суміші гептан/етиленхлориду, додають при перемішуванні воду і відганяють розчинник нагріванням суміші до 95 ° С. При такому методі концентрація ситостерину в водної суспензії може досягати 140 г/л.
Трансформація стеринів мікроорганізмами заснована на їх використанні в якості джерела вуглецю, тому стимуляція зростання трансформирующих штамів повинна призводити до збільшення виходу продуктів розщеплення стеринів. Процес стимулюється насиченням середовища киснем. Додавання в живильне середовище деяких масел в кількості 1-3 мас.% (Соєвого, арахісового, рапсової, оливкового) підвищує вихід продукту трансформації. Аналогічні результати отримані із застосуванням гліцеридів тваринного і рослинного походження (тристеарин, триолеїн, трипальмитин). Механізм стимуляції росту гліцеридами, ймовірно, полягає в усуненні гідрофобності стеринів, т. Е. Гліцериди діють так само, як неіонні ПАР (твін), зазвичай вживані для мікробіологічних процесів трансформації. Температурний режим мікробіологічних трансформацій стероїдів не відрізняється від прийнятих для інших мікробіологічних процесів і складає 24-33 ° С. Умови рН визначаються при відборі штаму культури-трансформатоа і коливаються в широкому інтервалі.
Мікробіологічний контроль здійснюється тільки на стадії вирощування трансформирующей культури. Аналітичний контроль реакції трансформації ведеться шляхом відбору проб через певні часові інтервали та аналізу їх методом тонкошарової хроматографії на Силуфол у присутності «свідків» - вихідного стероїду, цільового продукту трансформації і деяких проміжних і побічних продуктів, якщо вони беруть участь у даному процесі.
Після завершення трансформації культуральна рідина, відокремлена від міцелію (або іншої біомаси), екстрагується незмішувані з водою органічним розчинником, придатним для розчинення відповідного стероїду (етилацетат, метиленхлорид або хлороформ). Екстракт, відділений від водної фази, проходить необхідну очистку (пофарбовані домішки зазвичай відокремлюють обробкою з активованим вугіллям, потім вугілля відфільтровують); далі його концентрують у вакуумі та отриманий осад стероїду перекрісталлізовивают з підходящого розчинника. У препаративних цілях при роботі з невеликими кількостями стероїдів очистку продукту трансформації можна проводити методом колонкової...
