ж розмір проломи в рекомбинированного молекулі перевищує одну фосфодіефірную зв'язок, вона забудовується in vitro за допомогою ДНК-полімерази або in vivo за допомогою репарірующих систем клітини. p align="justify"> Отримання рекомбінантних РНК
Отримання рекомбінантних РНК звичайно здійснюють методами ферментативного або хімічного лігування РНК. Крім того, нещодавно з'явилася принципово нова можливість вбудовування сегмента РНК в задане положення інших молекул РНК за допомогою рібозімов. p align="justify"> Ковалентне зшивання окремих сегментів РНК при отриманні рекомбінантних молекул, як правило, здійснюють за допомогою Т4 РНК-лігази. Т4 РНК-лігаза закодована в геномі бактеріофага Т4. Її виділяють з клітин E.coli, заражених цим фагом. Фермент зшиває один з одним однотяжевие оліго-і полірібонуклеотіди. Для роботи Т4 РНК-лігази необхідне джерело енергії - аденозинтрифосфат. На рис. 2 наведена схема ферментативного лігування двох коротких олігонуклеотидів. Як видно з цієї схеми, акцептором в реакції лігування служить повністю дефосфорілірованний, а донором - повністю фосфорильований по кінцевим нуклеотидним залишкам олигонуклеотид. Це запобігає можливість зшивання однотипних олігонуклеотидів. p align="justify"> Ефективність ферментативного лігування досить довгих полирибонуклеотидов сильно варіює і її важко передбачити виходячи тільки з нуклеотидноїпослідовності сегментів РНК. Найкращі результати отримані в тих випадках, коли зшиваються кінці полирибонуклеотидов були просторово зближені за рахунок комплементарного зв'язування сусідніх з ними ділянок РНК. p align="justify"> Нещодавно було встановлено, що протяжні сегменти РНК (довжиною в 200-300 залишків) можуть бути з високим виходом зшиті Т4 ДНК-лігази. При цьому В«стикуванняВ» сегментів здійснюється за допомогою олігодезоксірібонуклеотіди, комплементарного 3'-кінця одного сегменту і 5'-кінця іншого. p align="justify"> Метод хімічного лигирование заснований на активації кінцевий фосфатної групи одного з двох зшиваємо сегментів РНК водорозчинним карбодиїмідів або
BrCN. У разі BrCN реакція протікає дуже швидко і не супроводжується модифікацією нуклеотидних залишків, хоча під дією карбодиїмідів фосфодіефірная зв'язок утворюється з більш високим виходом. Для того, щоб забезпечити сближенность зшиваних кінцевих нуклеотидних залишків у фрагментах РНК, було запропоновано використовувати олігодезоксірібонуклеотіди, комплементарні обом фрагментами в місці їх стику. p align="justify"> Хімічне лігування РНК, як правило, проходить з істотно меншим виходом, ніж ферментативне. Однак воно дозволяє отримувати рекомбінантні РНК з незвичайними типами межнуклеотидной зв'язку (наприклад, пірофосфатной) і незвичайними нуклеотидними залишками в місці стику двох фрагментів. p align="justify"> Отримання рекомбінантних РНК за допомогою рібозімов засноване на оборотності реакції самосплайсінга (за відсутності гуанозіна або гуанілова н...
