рідини, поділ, ідентифікацію та кількісне визначення ЛВ або його метаболітів.
Перед екстракцією необхідно осадити білки (сульфатом амонію, розчином трихлороцтової або хлорного кислоти). Для осадження білків використовують зазвичай пробу, яка містить близько 0,2 мл сироватки крові, до якої додають 0,5 мл 20%-ного розчину трихлороцтової кислоти і центрифугують при 3000 об/хв протягом 20 хв. При цьому досягається повне осадження сироваткових білків. Супернатант декантирують і екстрагують з неї випробовувані речовини.
Процеси екстракції аналізованих лікарських речовин та їх метаболітів з біологічних об'єктів здійснюють за допомогою таких органічних розчинників, як діетиловий ефір, хлороформ, бензол, дихлоретан, діхлорметан, я-гексан, ізопропілхлорід, я-гептан, метіленхлорід, етилацетат, ацетон. Нерідко поєднують в екстрагентів два із зазначених розчинників. Такий спосіб називаютдвухфазним екстрагуванням. Найкраща повнота поділу досягається, якщо послідовно витягують з біологічної рідини ЛВ або його метаболіти кількома розчинниками, наприклад ефіром, етилацетат, хлороформом, ацетоном, водою. Екстракцію проводять у присутності кислот, лугів або буферних розчинів, створюючи рН середовища, оптимальне для вилучення ЛВ або його метаболіту.
Речовини, що містяться в отриманих екстрактах (Реекстракт), визначають фотометричним, спектрофотометричним або флуориметричним методом.
Дуже перспективний чутливий екстракційно-фотометричний метод, заснований на екстракції ЛВ з біологічної рідини з подальшим взаємодією з кислотними або основними барвниками (бромтімоло-вим синім, метиловим оранжевим, бромкрезолового зеленим та ін.) Утворені пофарбовані продукти (іонні асоціати) нерідко специфічні для ЛВ і кількісно екстрагуються органічним розчинником (хлороформом, бензолом, дихлоретаном).
Найбільш часто в біофармацевтичному аналізі используютспектрофотометрию в УФ-і видимої областях спектра. Цей метод відрізняється простотою виконання і достатньою точністю, не вимагає великого кількості операцій при підготовці до аналізу випробуваного зразка. Порівняно невисока чутливість спектрофотометричних методик (від 1 мкг/мл до 1 мг/мл) обмежує застосування даного методу для тих груп ЛВ, добова доза яких становить близько 1 м.
Чутливість флуоріметріческого аналізу - близько 0,0! мкг/мл. У порівнянні з УФ-спектрофотометрією вона вища у 10-100 разів. Тому за допомогою флуоріметріческой методик можна піддавати біофармацевтичних аналізу ЛВ, добові дози яких становлять кілька міліграмів. Особливо високою чутливістю відрізняються спектрофлуоріметріческіе визначення. Однак слід враховувати, що в біологічних рідинах організму нерідко містяться речовини, що володіють флуоресценцією. Флуоресціровать можуть і метаболіти ЛВ.
Тонкошарова хроматографія (ТШХ) широко застосовується в біофармацевтичному аналізі зважаючи високої роздільної здатності та чутливості. Підвищити роздільну здатність ТШХ можна, використовуючи метод двовимірної хроматографії. Метод ТШХ дозволяє виявляти до 0,025 мг ЛВ. Виконання аналізу займає від 30 хв до 2 год ТШХ відрізняється простотою виконання, однак при аналізі складних сумішей, що містять велику кількість компонентів, цей метод не завжди дозволяє досягти потрібного ефекту. Більш перспективне використання ТШХ у поєднанні з такими методами, як планіметрия і денситометрія. Біофармацевтичний аналіз методом ТШХ найчастіше поєднують з УФ-спектрофотометрією і флуоресцентним методом (хроматоспектрофотометрія, хроматофлуоресценція).
Дуже перспективне використання в біофармацевтичному аналізі мас-спектрометрії. Метод відрізняється високою роздільною здатністю, в десятки разів перевищує інші методи. Відомі різні варіанти мас-спектрометрії. Один з них заснований на застосуванні мас-спектрометрії з низькою енергією іонізуючих електронів після попереднього виділення фракції біологічної рідини екстракцією або паперової хроматографії.
Газорідинна хроматографія (ГРХ) через високу чутливості, хорошою відтворюваності і точності стоїть на одному з перших місць серед фізико-хімічних методів, використовуваних для аналізу ЛВ та їх метаболітів у біологічних рідинах. Він дозволяє визначити мікрограммових і нанограммових кількості цих речовин. До виконання аналізу методом ГЖХ необхідно попередньо здійснювати багаторазову екстракцію (частіше ефіром, хлороформом або етилацетат) і реекстракції ЛВ або його метаболітів.
Очищений екстракт концентрують і упарюють насухо (якщо потрібно, в струмі сухого азоту). Залишок піддають ГЖХ аналізу в обраних оптимальних умовах з внутрішнім стандартом і використанням газу-носія-азоту при температурі випарника 245 В° С, детектора 305 В° С. Іноді екстрагуються речовини перетворюють спочатку в похідні, а потім виконують їх ГЖХ-аналіз. Відносна похибка методу В± (8-15)% при вмісті 10-25 нг/мл ЛВ в біологічної пробі.
Високоефективна або високошвидкісна рідинна хроматографія (ВЕРХ) відрізняється від ...
