і клони, що містять тільки цікавлять нас гени або їх фрагменти. Само собою зрозуміло, що це в принципі можливо тільки в тому випадку, якщо в вихідні клітини проникло в середньому по одній молекулі рекомбінантної ДНК. Спосіб же відбору клонів в значній мірі залежить від природи клонують гена. p align="justify"> Мабуть, найпростішим є випадок, коли клонують ген здатний комплементіровать ауксотрофності мутацію в штамі-реципієнті. У цьому випадку клітини висіваються на середу, позбавлену речовини, необхідної для зростання даного штаму, і тільки клітини, що містять рекомбінантний ДНК з потрібним геном, здатні рости на цьому середовищі. З таких клонів отримують гомогенну культуру клітин, яку використовують для отримання шуканого сегмента ДНК, проробляючи всі операції в зворотному порядку (тобто з клітин виділяють вектор, з нього виокремлює необхідний фрагмент ДНК і так далі). p align="justify"> Набагато частіше для відбору необхідних клонів доводиться вдаватися до методу ДНК-ДНК-або ДНК-РНК-гібридизації. Для цього необхідно розташовувати В«зондамиВ» (індивідуальними молекулами ДНК або РНК або їх фрагментами), комплементарними нуклеотидної послідовності клонують гена. Це можуть бути спеціально синтезовані олігодезоксірібонуклеотіди довжиною в 15-20 залишків, послідовність яких обрана на підставі повністю або частково відомої первинної структури гена або закодованого в ньому білка. Це можуть бути кДНК, синтезовані на індивідуальних РНК-копіях даного гена (як такі або у вигляді отклонірованних, тобто істотно помножених в кількості фрагментів ДНК). Нарешті, це можуть бути самі індивідуальні РНК, закодовані в даному гені. Ясно, що у всіх випадках В«зондиВ» повинні нести радіоактивну мітку (зазвичай 32 Р) з досить високою питомою активністю.
Якщо ж індивідуальний В«зондВ» недоступний, то застосовують методи, які з великого числа рекомбінантов (10 6 ) дозволяють вибрати порівняно невелику групу (близько 10 2 ), що включає рекомбінант з потрібним геном. Ця група поділяється на підгрупи (наприклад, на 10) по 10 рекомбінантов. З кожної підгрупи виділяється ДНК, яку використовують для синтезу мРНК і подальшої трансляції її з метою виявлення відповідного продукту шуканого гена.
Трансляція мРНК може бути здійснена в безклітинних системі. Однак у випадку еукаріотичних генів мРНК часто переносять у ооцити жаби (ксенопуса) за допомогою техніки мікроін'єкції, де вона транслюється. Продукт трансляції зазвичай виявляють за допомогою антитіл. p align="justify"> Далі в підгрупі, де виявлено шуканий ген, тим же методом досліджується кожен клон.
За наявності зонда з чашки Петрі, на якій вирощені колонії клітин, робиться відбиток (репліка) на нітроцелюлозні фільтрі. Клітинам дають вирости на фільтрі, п...
