n="justify">
1. Ампліфікація ДНК. 1) Нічні культури досліджуваних штамів з 1,5% агарізірованной середовища наконечником дозатора вносили в пробірки Еппендорф з 50 мкл дистильованої стерильної води і струшували. Кількість клітин оцінювали візуально за ступенем каламутності суспензії. p align="justify">) У пробірку Еппендорф додавали реактиви.
Таблиця 6
Реактиви для ПЛР
Порядок внесеніяРеактівВносімий об'ем1Вода дистильована стерільная100 мкл210х буфер18 мкл3Смесь праймерів PC 1/1 і PC 1/2, 2 пмоль/мкл, і PC 5/1 і PC 5/2, пмоль/мкл18 мкл4Смесь нуклеотідов18мкл5Taq-полімераза1 од. p align="justify"> Загальний об'єм суміші - 172 мкл.
) Отриману суміш реактивів розливали по 19 мкл в дев'ять пронумерованих пробірок Еппендорф, що стоять на льоду. У перші вісім пробірок вносили по 1 мкл відповідних клітинних суспензій. Дев'яту пробірку залишали без матриці, в якості негативного контролю. p align="justify">) Дев'ять зразків ампліфікували за наступною програмою:
. один цикл:
94 Вє C 5 хв;
.27 циклів:
94 Вє C 30 сек,
62 Вє C 30 сек,
72 Вє C 1 хв;
. один цикл:
72 Вє C 3 хв;
. Охолодження до 4 Вє C.
Проби зберігалися замороженими.
2. Електрофорез ДНК в агарозному гелі.
1) агарозному гель плавили на водяній бані.
) У електрофорезне апарат встановлювали планшетку для лунок, заливали розчином агарози. Після застигання агарози гребінку діставали. Планшетку з готовими лунками заливали буфером ТАЄ. p align="justify">) До розмороженим ампліфікувати пробам додавали 4 мкл 6-кратного завантажувального буфера. Вносили препарати в лунки. p align="justify">) У десяту лунку додавали ДНК-маркер для визначення розмірів фрагментів.
) Електрофорез проводили при напрузі 100В.
) Гель витягували з апарату і візуалізували в ультрафіолетовому світлі.
3. Результати досліджень та їх обговорення
Метою даного дослідження була оцінка можливості використання видоспецифічності праймерів для діагностики Ps. corrugata як збудника некрозу серцевини томата. Використовувалися праймери, розроблені методом ПЛР з випадковою ампліфікацією поліморфної ДНК. Зразки були піддані ампліфікації і електрофорезу.
...
