450) при довжині хвилі?=450 нм в початковий момент часу. Планшети інкубували при 37 ° C, проводячи вимірювання (A450) кожні 5 хвилин. Час передостаннього виміру - Tконечное. Для вимірювання поглинання формазану проби інкубували протягом 5 хвилин у термостаті, вимірювання поглинання формазану проведено на приладі для імуноферментного аналізу фірми Awareness, Microplate Rider Stat Fax 3200.
Визначення концентрації продукту реакції перетворення 7-етоксірезоруфіна в 7-гідроксірезоруфін здійснювали на підставі калібрування, побудованої за експериментальними даними (малюнок 3).
Малюнок 3 - Калібрувальна пряма для визначення активності ЛДГ
Згідно калібруванню відносна одиниця оптичної щільності відповідала змісту ЛДГ 0,430 нмоль/хв/мл (МО/мл).
2.4 Перелік випробувального обладнання
Всі роботи з культурами клітин проводилися в стерильному ламінарному боксі, культивування клітин - в СО 2 -інкубаторе.
Перелік необхідного обладнання представлений в таблиці 1
Таблиця 1 - Випробувальне обладнання, засоби вимірювання
Найменування, тіпЦентріфуга лабораторна ОПН - 3,02 Мікроскоп Axioskop40Термостат ТС 80М - 2 електричний суховоздушнийСушільний шафа СНОЛ - 67/350Мікроскоп АУ - 12Веси електронні Adventurer OHAUSІнкубатор СО2
3. Результати досліджень
. 1 Вплив наночастинок срібла на життєздатність клітин ліній А549, SHR і сублінії FL за результатами МТТ-тесту
Загибель клітин, індуковану наночастинками, оцінювали по зміні оптичної щільності розчину по відношенню до контролю. Результати представлені на малюнках 4.
Малюнок 4 - Вплив НЧ срібла на клітини різних ліній
Як показали результати МТТ-тесту, середня інгібіторна концентрація (IC50) наночастинок срібла - концентрація, яка на 50% пригнічує здатність клітин переводити сіль тетразоліна в формазану, визначена графічним способом, для клітин лінії А549 і сублінії FL практично збіглася і склала 1,3 і 1 мг/мл відповідно. В експерименті на кардіоміоцитах щури IC50 наночастинок срібла визначена на рівні 8 мг/мл.
Таким чином, дані, отримані в експерименті, свідчать про більш високої чутливості клітин ліній А549 і FL до дії наночасток в порівнянні з кардіоміоцитах щури. Ймовірно, це пов'язано з більш високою швидкістю розподілу трансформованих клітин і клітин амніону, а також інтенсивністю метаболізму.
. 2 Вплив наночастинок на життєздатність лімфоцитів людини за результатами МТТ-тесту
В експерименті на лімфоцитах людини, які культивували протягом 48 год, продемонстрована з наночастинками срібла (IC50=100 мкг/мл). Середня інгібіторна концентрація визначалася графічно. Результати експерименту представлені на малюнках 5.
Малюнок 5 - Вплив НЧ срібла на лімфоцити людини
Зіставивши результати МТТ-тесту на лімфоцитах людини і попереднього експерименту, можна зробити висновок про те, що НЧ срібла для лімфоцитів на порядок токсичнее, ніж для будь-використаної раніше культури клітин.
3.3 Вивчення цитотоксичності наноматеріалів для клітин лінії А549 за допомогою забарвлення метиленовим синім
Клітини лінії А549 висівали в 24-ямковий планшети, куди вносили НЧ срібла. Для оцінки життєздатності клітин використовували 0,4% розчин метиленового синього. Фарбування проводили через 8 і 24 год після внесення наночасток. Підрахунок числа клітин проводили в 5 довільних полях зору, розраховували середнє значення Результати експерименту представлені в таблиці 2.
Таблиця 2 - Вплив НЧ срібла в різних концентраціях на життєздатність клітин лінії А549
Варіант опитаЧісло клеток8 ч24 ч.Общее число клетокЧісло забарвлених клітин% гібельОбщее число клетокЧісло забарвлених клітин% гібельНЧ срібла, 100 мкг/мл67,24,66,888,45,66,3НЧ срібла, 300 мкг/мл742937, 342,232,677,2
Показано, що при збільшенні часу впливу ефект наночастинок срібла на клітини зростає. Можна зробити висновок про застосовність методу забарвлення клітин у культурі метиленовим синім для визначення цитотоксичної дії НЧ шляхом оцінки цілісності мембран клітин.
. 4 Вивчення життєздатності клітин у культурі по активності лактатдегідрогенази в середовищі культивування
Вивчено активність лактатдегідрогенази (далі - ЛДГ) в середовищі культивування клітин А549 при додаванні НЧ срібла в концентраціях від 100 до 1000 мкг/мл, експозиція склала 24 ч (таблиці 3).
