° С, 5% СО2, відносної вологості повітря 80% на 96-лункових планшетах (посівна концентрація - 50-70 тис. Кл./Мл). У лунки з прикріпилися клітинами (другу добу культивування) вносили досліджувані концентрації наносрібла, розчиненого в сироватці (Fetal Bovine Serum, Sigma, USA). Після 24-годинної експозиції досліджуваних зразків фотометрически вимірювалася сумарна активність мітохондріальних дегідрогеназ клітин в кожній лунці в метілтетразоліевом тесті (МТТ). Цей тест заснований на здатності живих метаболічно активних клітин переводити сіль тетразоліна (MTS) в формазану, розчинний у середовищі культивування. Таким чином, поглинання формазану прямо пропорційно кількості життєздатних клітин в культурі.
Для проведення МТТ використовували набір CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS), Promega. Для вимірювання поглинання формазану клітини інкубували з МТS протягом 20 хвилин в термостаті, вимірювання поглинання формазану при? =492 нм проводили на приладі для імуноферментного аналізу фірми Awareness, Microplate Rider Stat Fax 3200.
Результат оцінки статистично оброблений засобами Excel. Токсичність наночастинок оцінювалася за показником IC50 (середня інгібіторна концентрація - концентрація речовини, яка пригнічує на 50% дану клітинну функцію).
. 3.2 Метод оцінки життєздатності клітин у культурі за допомогою забарвлення трипановим синім (метиленовим синім)
Оцінка цілісності клітинної мембрани є одним з найбільш поширених способів виміряти життєздатність клітини і цитотоксичні ефекти. Сполуки, що володіють цитотоксичність, часто викликають порушення цілісності клітинної мембрани, що можна встановити за допомогою вітального фарбування трипановим синім (метиленовим синім), який вільно проникає через пошкоджену мембрану і забарвлює внутрішньоклітинні компоненти, але в здорових клітинах відсутня.
Для оцінки життєздатності більш надійним способом є фарбування клітинних суспензій, оскільки при фарбуванні прикріплених клітин вони можуть відкріплюйте від субстрату і губитися. Головним недоліком цього методу є неможливість виявлення клітин з порушеною здатністю до розмноження [14].
Для проведення експерименту з різними концентраціями НЧ срібла (100, 300 мкг/мл) клітини лінії А549 розсівали в 24-ямковий планшети. Після закінчення експозиції (8 і 24 ч) клітини відмивали від наночастинок фізіологічним розчином, фарбували 0,4% розчином барвника. Кількість мертвих забарвлених клітин підраховували в п'яти довільних полях зору.
. 3.3 Метод оцінки життєздатності клітин у культурі за допомогою визначення активності ЛДГ
Вимірювання активності лактатдегідрогенази використовується як один з основних тестів на цитотоксичність. Метод базується на збільшенні активності присутнього в цитоплазмі живих клітин ферменту в середовищі культивування, куди він виділяється через пошкоджені мембрани мертвих або вмираючих клітин. Невеликі кількості культурального середовища беруться через певні проміжки часу після впливу на клітини для вимірювання вивільненої лактатдегідрогенази визначення залежності токсичного ефекту від тимчасового чинника. У даному тесті можна оцінити загальну цитотоксичність в режимі реального часу.
Лактатдегидрогеназа - оксидоредуктаза, яка каталізує перетворення пірувату і лактату. Клітини виділяють ЛДГ в кров'яне русло після пошкодження або гемолізу еритроцитів. Оскільки ЛДГ є стабільним ферментом, його широко використовують для оцінки наявності пошкодження або токсичності для тканин і клітин. ЛДГ також підвищується при певних патологічних умовах, таких як рак. У використовуваному наборі ЛДГ відновлює НАД + в НАДН +, який специфічно детектується колориметричним методом (450 нм).
Вихідні розчини наночастинок готували шляхом диспергування в дистильованої воді з додаванням альбуміну за допомогою чотирикратної ультразвукової обробки загальною тривалістю 1 ч. Концентрація наносрібла - 100, 300, 600, 800, 1000 мкг/мл. Для проведення тесту використовували набір MAK066 Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit, Promega. Зміст ЛДГ визначали в безклітинних середовищі шляхом додавання субстрату (НАД +, сіль тетразоліна, натрію лактат та ін.). У ході визначення відбуваються наступні реакції: перша реакція - ЛДГ відновлює НАД + в НАДН шляхом окислення лактату до пірувату). У другій реакції каталізатор (діафораза) передає H/H + від НАДН до солі тетразоліна, утворюючи формазану. Для аналізу використовували проби сироватки. Додавали 2-50 мкл проби в лунки 96-лункового планшета в двох повторностях. Проби доводили до остаточного обсягу 50 мкл буфером для аналізу ЛДГ. У кожну лунку вносили по 50 мкл основний реакційної суміші. Добре примушували піпетуванням. Через 2-3 хвилини визначали Tісходное. Вимірювали оптичну щільність (A...
