Використання методу полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі для детекції хантавірусна РНК
В даний час метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в реальному часі широко використовується для діагностики різних, в тому числі і вірусних, захворювань. Пропонована методика дозволить проводити діагностику ГЛПС за досить нетривалий час. Методика включає в себе ПЛР у реальному часі, поєднану з попередньою реакцією зворотної транскрипції вірусної РНК і побудовою кДНК. Особливістю методики є проведення обох реакцій за допомогою одного ферменту - термостабільної ДНК-полімерази Thermus thermophilus, яка володіє обратнотранскрібірующей активністю в присутності іонів Mn І + і полімеразної активністю в присутності іонів MgІ +.
Башкортостан був і залишається одним з найбільших в світі районів-вогнищ ГЛПС. Збудниками ГЛПС є віруси роду Hantavirus (сімейство Bunyaviridae), які поділяються на кілька різних серотипів. Ізоляти, виділені в Башкортостані (Tkachenko et al., 1984), відносяться до серотипу Puumala, представники якого викликають менш важкі форми ГЛПС, ніж, наприклад, серотип Hantaan. Однак, за останні кілька десятиліть (з моменту реєстрації ГЛПС в 1957 р.), епідеміологічна картина мало змінилася. ГЛПС по захворюваності займає перше місце серед природно-вогнищевих інфекцій в РФ. Число зареєстрованих випадків в окремі роки може досягати 20 тисяч і більше, нерідкі летальні результати (Морозов, 2001; Ткаченко, Дроздов, 2002). Тому розробка швидких і ефективних діагностичних тестів є актуальною проблемою.
Полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі має кілька переваг перед звичайною ПЛР (Klein, 2002; Tse, Capeau, 2003, Mackay, 2004):
1. можливість спостереження за накопиченням цільового продукту в даний момент на будь-який з стадій реакції ампліфікації
2. відсутність постреакціонних маніпуляцій для детекції освіти цільового продукту (електрофоретичний аналіз і пр.), і, внаслідок цього
. скорочення часу від початку проведення ПЛР до отримання кінцевого результату.
При цьому, з використанням нової термостабільної ДНК-полімерази Thermus thermophilus (Tth-полімерази), з'явилася можливість проводити побудова кДНК і подальшу її амплификацию в одній пробірці (Myers, Gelfand, 1991), знову ж, значно скорочуючи час проведення реакції.
Матеріали і методи
Рібоолігонуклеотід. Для постановки модельних експериментів був синтезований 35-членний рібоолігонуклеотід HVIRNA (НПФ «синтола», Москва.), Відповідний консервативному ділянці S-сегмента РНК хатавіруса штаму CG - 1820 / Уфа - 83 (серотип Puumala):
- UGGCAUUUACAUCAAGGACAUUUCCAUACCUAAGG - 3
Праймери. Для проведення синтезу кДНК використовувався 16-членний праймер HV1, відповідний ділянці з 288 по 303 нуклеотид «+» ланцюга кДНК S-сегмента штаму CG - 1820 / Уфа -83:
- TAGGTATGGAAATGTC - 3,
або відповідний тій же ділянці кДНК праймер HV1-FAM (або його 21-членний аналог HV11-FAM), мічений флуоресцентним барвником карбоксіфлуоресцеіном (місце модифікації вказано великою літерою):
