gn="justify"> - taggTatggaaatgtc - 3 (5 - aggcttaggTatggaaatgtc - 3).
Для подальшої ампліфікації отриманої кДНК використовувалися пари праймерів HV1/HV3 і HV1-FAM/HV3-ROX відповідно. Праймер HV3 комплементаріїв ділянці з 304 по 320 нуклеотид «+» ланцюга кДНК S-сегмента штаму CG1820 / Уфа - 83:
- TGGCATTTACATCAAG - 3.
Праймер HV3-ROX комплементаріїв тій же ділянці кДНК і мічений флуоресцентним барвником карбокси-Х-родаміном:
- tggcaTttacatcaag - 3.
Праймери HV1 і HV3 були синтезовані в нашій лабораторії, праймери з флуоресцентною міткою - НПФ «синтола», Москва.
Для детекції результатів у реальному часі в реакції з немічених праймерами використовували інтеркалірующій флуоресцентний барвник SYBR Green I (Molecular Probes, USA), специфічний для двуцепочечной ДНК, який додавався безпосередньо в реакційну суміш.
Ферменти. Синтез кДНК і подальша ПЛР проводились за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази Thermus thermophilus - Tth-полімерази («Сібензім», Новосибірськ). Важливим моментом є здатність Tth-полімерази вести зворотний транскрипцію. Потрібно відзначити, що цією здатністю Tth-полімераза володіє тільки в присутності іонів Mn І +, а для полімеразної активності необхідні іони MgІ + (Гребенникова та ін, 1995). Тому, при проведенні реакції, після стадії побудови кДНК в буферній системі, яка містить іони Mn І +, в реакційну суміш додавалися іони MgІ + в достатній для полімеразної активності ферменту концентрації.
Синтез кДНК і ПЛР у реальному часі. Синтез комплементарної модельному рібоолігоонуклеотіду ДНК і подальшу амплификацию отриманої кДНК проводили в приладі iCycler iQ фірми Bio-Rad (USA), в 30 мкл реакційної суміші, що містить буфер для реакції зворотної транскрипції (1 х 50мм Tris-HCl, pH=8,5 / 25єС; 100мM KCl, 0,5 мM MnCl2), 0,25 ммоль суміші dNTP, 40 пкмоль кожного праймера (тому обидві реакції йдуть один за одним, то в реакційну суміш додається відразу пара праймерів), 1 пкмоль рібоолігонуклеотіда і 1-2 од. Tth-полімерази. Критичною стадією при проведенні даної реакції є стадія відпалу праймера-затравки на рібоолігонуклеотідной матриці і подальше побудова кДНК. Тому час для проведення цих операцій було свідомо завищено і склало 5 хв. на кожну стадію: перша стадія - отжиг праймера при 32єС - 5 хв., синтез кДНК при 50єС - 5 хв., потім в реакційну суміш додавали MgCl2 до кінцевої концентрації 10мм і проводили другу стадію - 25 циклів - 80єС - 4 с., 32єС- 8 с. Вся реакція, включаючи і час на додавання в реакційну суміш іонів MgІ +, займає менше однієї години.
Паралельно для наочності та порівняння ефективності методів проводилися ПЛР у реальному часі з кДНК, отриманої за допомогою двох зворотної транскриптази: M-MLV-зворотна транскриптаза, фірми «Сілекс» і AMV Reverse Transcriptase, фірми «Promega» . Синтез кДНК проходив на тій же самій рібоолігонуклеотідной матриці в загальному обсязі 20 мкл при розведенні її в 10 разів. Реакційна суміш складалася з буфера (для M-MLV - зворотної транскриптази: 1 х 70мм Tris-HCl, pH=8,3 / 25єС, 16,6 мМ (NH4) 2SO4, 75мM MgCl2; для AMV - зворотної транскриптази: 1 х 25мм Tris-HCl, pH=8,3 / 25єС, 25мм KCl, 5мм MgCl2, 0,25 мМ спермидин, 5мм DTT), 0,25 ммоль суміші dNTP, 10 пкмоль праймера HV1 або HV1-FAM (HV11-FAM), 1 пкмоль рібооліго...
