тигену здійснюється фосфатно-сольовим буфером містить 0.1% Tween - 20 (PBSТ).
2.Блокіровка Для блокування місць неспецифічного зв'язування лунки планшета заповнюють PBST і інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі. .Інкубація З антигеном
У лунки планшета з преадсорбірованимі антитілами вносять по 50 мкл досліджуваного розчину небудь стандартних розведень антигену. Розведення антигену повинні бути приготовлені на основі PBST, оскільки Tween - 20 знижує неспецифічне зв'язування білкових молекул один з одним і з поверхнею планшета. І досліджуваний розчин, і стандартні розведення антигену вносять попарно (або по 3 повторності), використовуючи по два (три) лунки на кожне розведення білка. Інкубацію проводять при кімнатній температурі протягом 30 хв при постійному перемішуванні.
Відмивання здійснюється розчином PBST 3 рази.
. Інкубація з антитілами, кон'югованими з ферментної міткою
У лунки планшета вносять по 100 мкл розчину специфічних антитіл, кон'югованих з ферментної міткою. Оптимальна концентрація кон'югованих антитіл як правило вказується виробником (зазвичай використовують концентрацію 2-4 мкг/мл) .Інкубація з антитілами, що містять ферментну мітку, проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.
. Проведення ферментативної реакції, що супроводжується появою забарвленого продукту
У лунки вносять по 100 мкл розчину субстрату і інкубують протягом 10 хв при кімнатній температурі і постійному перемішуванні.
6. Зупинка ферментативної реакції Перед вимірюванням оптичної щільності проводять зупинку кольоровій реакції з допомогою 0.5 М Н2SО4.В лунки з робочим розчином ОФД після інкубації вносять по 50 мкл розчину 0.5 М сірчаної кислоти. Після цього можна відразу приступати до вимірювання оптичної щільності.
. Вимірювання оптичної щільності
Оптична щільність розчину забарвленого продукту вимірюється при л=490 нм з використанням планшетного спектрофотометра.
Постановка ПЛР:
Загальний обсяг реакції - 25 мкл, об'єм ДНК-проби - 10 мкл. Проводиться в ЗОНІ 2 - кімнаті для підготовки та проведення ПЛР-ампліфікації.
Необхідне обладнання:
. Ампліфікатор (наприклад, «Терцик» (ДНК - технологія); «GeneAmpPCRSystem 2400», «GeneAmpPCRSystem 2700» (AppliedBiosystems); «GradientPalmCycler» (CorbettResearch); «Biometra».
. ПЛР-бокс
. Мікроцентрифуга
. Окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (5-40 мкл, 40-200 мкл).
. Штативи «робоче місце» для мікропробірок на 0,5 мл.
. Одноразові мікропробіркі для ПЛР на 0,5 мл або 0,2 мл.
. Одноразові наконечники до 100 мкл з фільтрами в штативах для автоматичних піпеток з перемінним об'ємом.
. Одноразовий халат і одноразові рукавички.
. Ємність для скидання наконечників.
. Холодильник на 2- 8 ° С; морозильник на мінус 20 ° С для зберігання виділеної ДНК.
Необхідні реактиви
Таблиця 2. Комплект «АмпліСенс»
РеактівАмпліСенс - 100- RОб'ем (мл) Кількість (шт.) ПЛР-суміш - 1 * 0,005110ПЦР-суміш - 21,11Мінеральное масло для ПЦР4,01ДНК-буфер1,01Рассчітан на 110 реакцій * - ПЛР-суміш - 1 поміщена під віск.
Таблиця 3. Контрольні зразки
РеактівОб'ем (мл) Кількість (шт.) ПКО ДНК (позитивний контрольний зразок ДНК) 0,11ДНК-буфер (буфер для розведення та зберігання ДНК) 1,01
У всіх наборах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується «гарячий старт», який забезпечується поділом нуклеотидів і Taq -полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при установці пробірок в ампліфікатор, нагрітий до 95 0 С, що значно знижує кількість неспецифически зацькованих реакцій.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР:
. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю - 1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.
. Внести по 10 мкл ПЛР-суміші - 2, при цьому вона не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю - 1.
. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 15-25 мкл).
. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з фільтрами внести по 10 мкл ДНК, ви...
