діленої з клінічних проб або контролів етапу виділення.
. Додаткові пробиРСІ призначаються для контролів етапу ПЛР (див. нижче):
а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;
б) позитивний контроль (К +) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК (ПКО);
. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. Табл.).
Програми ампліфікації ДНК збудників інфекцій, що передаються статевим шляхом.
. Коли температура в комірці ампліфікатора досягне 95 ° С, помістити пробірки в осередки ампліфікатора, закрити кришку приладу і зняти програму з паузи.
. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (ЗОНУ 3). Проби після ампліфікації можна зберігати протягом 16 годин при кімнатній температурі, до одного тижня при 2-8 ° С і тривало при мінус 20 ° С (проте перед проведенням електрофорезу необхідно нагріти пробірки до кімнатної температури для розм'якшення воску). Аналіз продуктів ампліфікації проводиться поділом фрагментів ДНК в агарозному гелі. Іммуноблотінга - сучасний високочутливий аналітичний метод, використовуваний для визначення в зразку специфічних білків за допомогою антітел.Ідентіфікація досліджуваного білка (наприклад, онкобелкі та ін.) В складних сумішах або екстрактах різних тканин є однією з часто зустрічаються завдань. Використовуючи такий інструмент як специфічні антитіла, можна визначити досліджуваний білок з мінімумом тимчасових і фінансових витрат. Імуноблоттінг використовується в молекулярній біології, біохімії, генетіке.Метод заснований на комбінації гель-електрофорезу і імуннохімічної реакції «антиген-антитіло». За допомогою гель-електрофорезу білки поділяються в поліакриламідному гелі. Далі білки переносять на нітроцелюлозну або PVDF мембрану. Потім їх детектируют з використанням антитіл методом «сендвіча»: спочатку білки зв'язуються з первинними (моно- або поліклональними) антитілами, які у свою чергу зв'язуються з вторинними антитілами, кон'югованими з ферментами (пероксидазою хрону або лужною фосфатазою). Візуалізація досліджуваного білка досягається шляхом проведення відповідної біохімічної реакції з утворенням продукту, який визначається колориметричним, хемілюмінесцентним, флюоресцентним методами детекції. Кількість білка може бути оцінений за допомогою денситометрії. Високий ступінь дозволу досягається за рахунок електрофоретичного розділення білків і специфічності моноклональних антитіл. У оптимально відпрацьованих умовах Вестерн-блот можна виявляти антиген в кількостях менше 1нг.
Етапи иммуноблоттинга:
. Поділ білків методомгель-електрофорезу
. Перенесення білків на мембрану
. Блокування
. Детекція
. Поділ білків методом гель-електрофорезу. Найбільш поширений спосіб розділення білків - електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (англ. SDS) за методом Леммлі. Підлягають аналізу білки в присутності додецилсульфату натрію набувають однаковий негативний заряд, що робить можливим їх поділ в залежності тільки від молекулярної маси. Попередньо денатуровані білки вносять в кишені «треків» (доріжок) акріламідного гелю з низькою концентрацією (концентрує гель), що дозволяє їх сконцентрувати перед переходом в розділяє гель (з більш високою концентрацією), де відбувається поділ білків в залежності від молекулярної маси. Білки мігрують в електричному полі через акріламідний гель до анода, при цьому білки меншого розміру рухаються швидше. Як правило, одну з «доріжок» залишають для маркерів молекулярної маси (суміші білків з відомими масами). Відмінності в швидкості просування - електрофоретичної рухливості призводить до поділу білків на смуги. Концентрація акриламіду визначає роздільну здатність гелю - чим вище концентрація акриламіду, тим краще поділ низькомолекулярних білків. Низька концентрація акриламіду покращує роздільну здатність гель-електрофорезу для високомолекулярних білків.
. Перенесення білків на мембрану. У методі електроблоттінга перенесення білків з гелю на мембрану (виготовлену з нітроцелюлози або полівініліденфториду (англ. PVDF) відбувається під дією електричного струму. Білки переміщаються з гелю на мембрану із збереженням свого розташування. В результаті цього процесу (від англ. Blotting-промокання) білки опиняються в тонкому поверхневому шарі мембрани і доступні для подальшого зв'язування з антитілами. Обидва варіанти мембран використовують через їх властивості неспецифічно пов'язувати білки. Зв'язування білків засноване як на гідрофобних взаємодіях, так і на електростатичних взаємодіях між мембраною і белком.Еффектівностьелектроблоттінга значно підвищується при викори...
