х зразках, як плазма крові. (рис. 2)
Непрямий імуноферментний аналіз (indirect ELISA).
Метод непрямого іммуноаналза характеризується здійсненням 3-х стадійного процесу, на першій стадії якого антиген адсорбується на спеціально підготовленому пластиці, на другий з антигеном взаємодіють специфічні до нього антитіла, а на третій в систему вводять антивидові антитіла, кон'юговані з ферментом, що обумовлює проведення індикаторної ферментативної реакції. У даній методиці як ферменту використовують пероксидазу хрону. Реакція проводиться в спеціальних 96-лункових планшетах. 1.Сорбція антигену У лунки 96-лункового планшета для проведення імуноаналізу сорбують антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.
Відмивання (2-х кратна) несвязавшихся молекул антигену здійснюється фосфатно-сольовим буфером містить 0.1% Tween - 20 (PBSТ). . Блокування
Для блокування місць неспецифічного зв'язування лунки планшета заповнюють PBST і інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі.
3. Растітровка специфічних антитіл Растітровку можна проводити як по горизонтальних, так і по вертикальних рядах планшета. Необхідно відзначити, що растітровка антитіл проводиться в тому випадку, якщо необхідно підібрати оптимальну концентрацію антитіл або визначити титр. У тому випадку, якщо оптимальна концентрація та/або титр антитіл визначені, то використовують рекомендоване для даних конкретних антитіл розведення.
При растітровке в першу лунку ряду вносять готове розведення антитіл - в середньому 1-10 мкг у лунку, далі проводять послідовне розведення антитіл в лунках. Інкубацію зі специфічними антитілами проводять протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.
Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 3 рази.
4. Додавання антивидових антитіл, кон'югованих з ферментної міткою В якості детекторних (вторинних) антитіл використовуються антівідовиеполіклональние антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону. Найчастіше використовуються козячі або кролячі антитіла, специфічні до цілої молекулі або до Fc-фрагментами специфічних антитіл. Концентрація детекторних антитіл як правило вказується виробником у вигляді розведення вихідного розчину (наприклад, 1: 1000).
Інкубація з вторинними антитілами проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетов.Отмивка здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.
Пероксидаза хрону каталізує реакцію окислення субстрату перекисом водню. Як субстрат пероксидази хрону використовується о-фенілендіамін (ОФД). У результаті проходження реакції утворюється забарвлений продукт окислення ОФД. Розчин субстрату: До 10 мл субстратного буфера (0.1 М Na-цитратний буфер, рН 4.5) додати 0.01 мл 30% перекису водню і 0.2 мл 50х розчину ОФД (340 мг ОФД в 10 мл етилового спирту; зберігати при - 20 ° С). Інкубація проводиться протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. . Зупинка ферментативної реакції Перед вимірюванням оптичної щільності проводять зупинку кольоровій реакції з допомогою 0.5 М Н2SО4.В лунки з робочим розчином ОФД після інкубації вносять по 50 мкл розчину 0.5 М сірчаної кислоти. Після цього можна відразу приступати до вимірювання оптичної щільності. . Вимірювання оптичної щільності Оптична щільність розчину забарвленого продукту вимірюється при л=490 нм з використанням планшетного спектрофотометра.
Прямий імуноферментний аналіз:
Методика прямого імуноаналізу має лише невеликі відмінності в порівнянні з методикою непрямого імуноаналізу. Так, стадії 1 і 2 однакові в обох типах аналізу. Відмінність полягає в тому, що в прямому варіанті імуноаналізу на стадії 3 використовують специфічні антитіла, кон'юговані з ферментної міткою. При необхідності також можна проводити растітровку специфічних антитіл, кон'югованих з ферментної міткою, аналогічно описаному раніше для некон'югованих антитіл. Стадія 4 опускається, а подальші стадії (5-7) проводяться аналогічно описаному вище для непрямого варіанта імуноаналізу.
імуноаналізі сендвіч-типу:
У даному варіанті імуноаналізу використовується пара антитіл, специфічних до просторово удаленнимепітопам досліджуваного антигену.
. Сорбція антитіл підкладки
У лунки 96-лункового планшета для проведення імуноаналізу сорбують антитіла підкладки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.
Відмивання (2-х кратна) несвязавшихся молекул ан...
