гетеродуплекса також користуються правилом В«найближчого сусідаВ» і розраховують її за допомогою відповідних програм.
Експериментально можна знайти ефективну константу швидкості k eff брутто-реакції перетворення мРНК M в умовний продукт X (ця умовність НЕ впливає на результат кінетичних розрахунків, але значно їх спрощує):
В
Ефективна константа швидкості брутто-реакції показує спостережувану швидкість розщеплення мРНК-мішені.
Механізм реакції можна представити наступною схемою:
В
У цій схемі E - фермент РНКаза H, HE - проміжний комплекс її з субстратом H, K 1 - константа асоціації гетеродуплекса, що розраховується за формулою (3).
Для даної кінетичної схеми можна скласти систему кінетичних рівнянь:
В
де С A - концентрація речовини A, k i - константа швидкості i-й елементарної реакції.
Зазвичай вимірюваним параметром є концентрація мРНК в розчині (вихідна C M0 і поточна C M ), тому k eff вважають відносно до матриці:
В
Використавши квазістаціонарне наближення по проміжному продукту HE і спростивши вираз для швидкості реакції w за допомогою рівняння Міхаеліса - Ментен:
В
де - константа Міхаеіса, можна перетворити вираз для швидкості зміни концентрації гетеродуплекса H:
В
Знайдемо вираз для ефективної константи швидкості розщеплення мРНК-мішені в двох випадках: коли процес лімітується зв'язуванням мРНК антисмислового ODN і лімітується каталітичним розщепленням мРНК-мішені у складі гетеродуплекса.
Випадок 1. Лімітування гібридизацією. p> У цьому випадку процес розщеплення йде значно швидше, ніж гібридизація. Тому можна допустити припущення про встановлення стаціонарної концентрації гетеродуплекса H, тобто:
В
З іншого боку, легко побачити (6), що:
В
тому:
В
Тобто, в даному випадку вираз для швидкості розщеплення мРНК збігається за абсолютним значенням з виразом швидкості реакції (швидкості утворення умовного продукту Х). Скориставшись цим, перетворимо вираз для швидкості зміни ко нцентраціі олігонуклеотиду, ми побачимо, що його концентрацію можна вважати практично незмінною:
В
Скориставшись виразом (14) і, як наслідок, нехтуючи внеском члена k-1Сh в знаходимо швидкість розщеплення мРНК в новому вигляді і висловлюємо keff.
В
Ви...
