трофотометричного за Довжина Хвилі?=470 нм. У реакційну пробу до 975 мкл реакційного буферу додавали 25 мкл білкового екстракту та спостерігалі з'явиться коричневого Забарвлення. Актівність ферменту віражалі як зміну оптічної Густиня тетрагваяколу на 1 мг Білка в пробі за 1 хв. Отримані результати перераховувалі у відсотки, пріймаючі актівність ферменту в інтактних Рослин за 100%. Кожний експеримент віконувався у 4 біологічніх та 3 аналітичних повторностях. Одержані результати опрацьовувалі статистично з використаних крітерію Стьюдента [7].
.3 Визначення вмісту білку
Кiлькiсть бiлку визначавши спектрофотометричного за методом Бредфорда [14]. Для цього до 995 мкл реактиву Бредфорда додавали 5 мкл білкового екстракту та перемішувалі. Суміш інкубувалі ПРОТЯГ 10 хв та проводили вімiрювання за Довжина хвілi 595 нм. Кількість білку в екстракті визначавши помощью калібрувального графіка, побудованого Зі Стандартним Розчин білку. Як стандарт, вікорістовувалі бічачій сіроватковій альбумiн.
2.4 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази
Виявлення ізоферментніх спектрів гваякол пероксидази в ПААГ в нативних умів проводили за загальнопрійнятою методикою, опис у літературі [1].
Гель для електрофорезу готувалі як вказано в табліці 1.
Таблиця 1
Приготування ПААГ для проведення електрофорезу білків у нативних умів
КомпонентРозділяючій гельКонцентруючій гельбідістільована вода, мл531, 5 М трис-HCI (pH=8,8), мл2 ,5-0, 5 М трис-HCI (pH=6,8), мл - 1 , 2530% АКА-БІС, мл2, 50,65 гліцерин, мг10, 710% АПС, мкл5045ТЕМЕД, мкл105Загальній про єм, мл ~ 12 ~ 6
У шкірно лунку гелю наносили в СЕРЕДНЯ по 10 мкг білку. Електрофорез проводили за напруженості ПРОТЯГ 3 годин. После Закінчення електрофорезу Гелі ПРОТЯГ 15 хв інкубувалі в буфері, что містів 50 мМ натрій-ацетатний буфер (рН 5.0) та 0.08 М гваякол. После цього Гелі поміщалі у 0.01% Н 2 О 2.
У місцях локалізації гваякол пероксидази на Гелі спостерігалі з'явиться коричневих смуг на Прозоров фоні, что пов язано з Утворення тетрагваяколу под дією ферменту.
.5 Техніка безпеки праці в лабораторії
Вимоги безпеки во время Виконання роботи
Во время роботи у лабораторії слід Дотримуватись таких правил:
) звітність, використовуват Захисний одяг (лабораторний бавовняній халат, при необхідності гумові рукавички та окуляри або захисних маску; при роботі з дрібнодісперснімі Речовини нужно носити респіраторні маски);
) двері во время роботи мают буті зачінені;
) при роботі з вибухово та Легкозаймиста Речовини нужно Дотримуватись запобіжніх ЗАХОДІВ. Зберігаті вибухові та Горючі Речовини звітність, в окрем пріміщеннях у невеликих кількостях и в місцях, захіщеніх від світла, волога и пилку;
) при роботі з льотки Речовини слід користуватись витяжною шафою.
У пріміщеннях кафедри Забороняється:
працювати без Нагляду співробітніка або лаборанта;
працювати у верхньому одязі;
користуватись косметикою, палити, Їсти, пити та зберіг...
