10 мг тканин нирки або 5 мг тканин аорти розсуспендовувалі у 100 мкл буферу RIPA (50 mM Tris-HCl (pH 7,2); 1% Triton X -100; 1% деоксихолат натрію; 0,1% SDS; 158 mM NaCl; 1 mM EГТА), Який містів інгібіторі протеаз/пептидаз: пепстатін (20 мкг/мл), апротінін (20 мкг/мл) та PMSF (1 мМ). Суспензію вітрімувалі при температурі +4 ° С течение 20 хв піля чого центріфугувалі 15 хв при 12000 об./Хв и температурі 4 ° С. Супернатант відбіралі та прогрівалі при 95 ° С в течение 5 хв у буфері Леммлі (62,5 мМ трис-HCl (pH 6,8), 1 мМ ЕДТА, 2% SDS, 5%? - Меркаптоетанол, 10% гліцерин, 0,4 % бромфеноловий синій).
2.11.2 Електрофорез протеїнів у поліакріламідному Гелі
Протеїні (50 мкг) розділялі електрофоретічно у блоках 10% поліакріламідного гелю у прісутності додецилсульфату натрію (SDS) у буферній сістемі Леммлі.
Для Приготування гелю вікорістовувалі Такі реактиви:
. Розчин мономерів АА: 30% акріламід та 0,8% метіленбісакріламід;
. Буфер А для розділяючого гелю: 0,375 М трис-HCl, pH 8,8;
. Буфер Б для концентруючого гелю: 0,125 М трис-HCl, pH 6,8;
. 10% персульфат амонію (APS).
. 10% додецилсульфату натрію (SDS)
. Буфер для електрофорезу (0,025 М трис-HCl, pH 8,3, 0,192 М гліцін, 0,1% SDS).
В установку для електрофорезу, у простір между двома Склянов пластинами вносили 10% -вий розділяючій (3,28 мл H 2 О; 2,64 мл «АА»; 2 мл «А»; 0, 8 мл SDS; 0,4 мл APS; 0,04 мл ТЕМЕД) та 4% -вий концентруючій (1,83 мл H 2 О; 0,39 мл «АА»; 0,75 мл «Б»; 0,3 мл SDS; 0,3 мл APS; 0,03 мл ТЕМЕД) Гелі. У електрофоретічну установку заливали буфер для електрофорезу.
Електрофорез проводили течение 2,5 рік при сілі Струму 15 мА, напрузі 200 В та потужності 50 Вт на одну пластину. При переході проб з концентруючого гелю у розділяючій, силу Струму збільшувалі до 25 мА на одну пластину. Для визначення молекулярної масі протеїнів, бенді якіх проявити, вікорістовувалі протеїнові стандарти (SDS7B2, «Sigma», США)
2.11.3 Імоноблотінг протеїнів
Отрімані розділені протеїні переносили на нітроцелюлозну мембрану під дією електричного поля з Наступний Обробка отриманий блотів антітіламі перенесеного проводили течение 2 рік при сілі Струму 250 мА, в буфері, что містів 25 мМ трис-HCl (pH 8, 3), 20% метанол та 192 мМ гліцін. Вільні центри зв язування на мембрані блокувалі течение 12 рік при 4 ° С 2% розчин BSA в ЗФР ??(137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na 2 HPO 4, 1,7 мМ KH 2 PO 4, ( pH 7,3)) з 0,05% ТВІН - 20.
согласно до поставленої мети мембрану інкубувалі З першого антітіламі (моноклональні антитіла до 3-нітротірозіну, N5538, Sigma, США), розведения у 10000 раз у блокуючому буфері, протягом 2 рік з Наступний проміванням буфером для Блокування (5 разів по 3 хв). Як друг?? антитіла вікорістовувалі анти-мішачі IgG (AP308P, Millipore, США), кін юговані з пероксидазою хрону, в розведенні у 1000 у блокуючому буфері. Інкубацію з іншими антітіламі проводили течение 1 рік, после чего мембрану відмівалі ЗФР/0,1% ТВІН - 20 (5 разів по 3 хв). Імунореактівні Смуги на блот виявляв помощью набору реактівів для посиленої хемілюмінесценції (Millipore, США). Година експонування мембран на рентгенівській плівці залежався від інтенсівності хемілюмінесценції и чати у Середнев 5-15 хв. Плівку проявляли у стандартному фенідон-гідрохіноновому проявніку та фіксувалі кислих фіксажем. Денситометричне аналіз результатів вестерн-блотингу здійснювалі з використанн програми GelPro 3.1.
Для контролю ідентічності вмісту протеїнів у всех пробах, мембрану відмівалі від Антитіл буфером для відмівкі (ЗФР/0,1% ТВІН - 20) та, в подалі, блокуючім буфером. После цього ее інкубувалі З першого анти-?-актіновімі антітіламі (Sigma, США), іншими антітіламі та проводили експозіцію отриманий блотів на рентгенівську плівку.
2.12 статистичності обробка результатів
статистичності обробка результатів дослідження здійснювалася з помощью програми Microsoft Excel. Обчислення основних статистичних показніків проводили за безпосереднімі кількіснімі Даними, отриманий в результате ДОСЛІДЖЕНЬ (Середнє Арифметичний значення - М; стандартна похібка Середнев Арифметичний - m).
Для ОЦІНКИ вірогідності різниці между статистичності характеристиками двох альтернативних сукупно даних обчіслювалі коефіцієнт Стьюдента. Вірогідною вважаться різніцю при показах вірогідності р? 0,95 (рівень значімості Р lt; 0,05), знайдену после обчислення t за таблицею t-розподілу Стьюдента.
Розділ 3. Результати ДОСЛІДЖЕНЬ
3.1 дослідження ...
