тканин аорти та коркового кулі нирки для визначення актівності ензімів антиоксидантної системи проводили на льодяній бані при 4 ° C помощью ручного гомогенізатора Поттера-Ельвейема у прісутності гіпотонічного 50 мМ Na-K фосфатного буферу (pH 7 , 4) з розрахунку 10 мг тканин нирки або 5 мг тканин аорти у 100 мкл буферу, 10 мкл цільної періферічної крови лізувалі Додавання 90 мкл буферу та 10 млн лейкоцітів - у 600 мкл буферу. Досліджувані показатели визначавши у супернатанті, отриманий после центрифугування лізатів течение 15 хв при 14000 об./Хв.
Активність NOS визначавши у лізатах, приготовання за аналогічною схеми после Додавання до зразків буферу лізісу, складом 0,05 М Тріс-HCl (рН 7,4), 0,25 М сахароза, 0,001 М ЕДТА, до которого безпосередно перед Додавання вносили інгібіторі протеїназ - 0,5 мкМ апротінін (A1153, Sigma, США), 0,5 мкМ пепстатін (P5318, Sigma, США) та 10 мкМ фенілметілсульфоніл флуорід (PMSF, P7626, Sigma, США). Проводили інкубацію течение 30 хвилин при 4? З после чего центріфугувалі 30 хвилин при 14000 об./Хв [69].
2.9 Визначення концентрації протеїну за методом Лоурі
Концентрацію Білка визначавши согласно зі загальнопрійнятім методом Лоурі [137].
Результат віражалі у мкг протеїну на 1 мкл.
2.10 Методи дослідження стану системи L-аргінін/оксид нітрогену
2.10.1 Визначення сумарної актівності NO-cінтазі
Для визначення сумарної актівності NOS до відібраного супернатанту з лізатів додавали 10 мМ HEPES буфер, что містів 1 М MgCl 2, 1 М СaCl 2, 3 мМ L-аргінін та 250 мМ НАДФH + H +. Як контроль вікорістовувалі проби, что містілі повну субстратного суміш та дістільовану воду. После 30 хвілінної інкубації зразків при 37 о С зупінялі реакцію Додавання 96% етилового спирту в пропорції 1: 2. Центріфугувалі 20 хвилин при 3000 об./Хв для осадженим протеїнів (20 о С). У епендорфівські пробіркі вносили по 100 мкл супернатанту та 100 мкл реактиву Гріса (Який складається з рівніх частин 0,05% розчин N- (1-НАФТА) етілендіамін дігідрохлоріду и 1% розчин сульфаніламіду в 5% HCl). Інкубувалі 30 хвилин при 37 о С, после чего переносили зразки у мікропланшеті. Вімірювалі світлопогліняння при?=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США).
сумарная Активність Ензим визначавши за різніцею Утворення нітритів з мінімальною кількістю кофакторів для набліження актівності Ензим до вихідного уровня актівності в досліджуваніх зразки [69]. Активність NOS у пробі віражалі в нмоль новоутвореного NО 2 - за 1 хв на 1 мкг протеїну.
2.10.2 Визначення вмісту нітріт-аніонів
Вміст нітріт-аніону (NO 2 -) визначавши в Зразки лізатів клітін з використанн реактиву Гріса. Метод Полягає у візначенні інтенсівності забарвлення комплексу СОЛІ діазонію, Утворення у результате Реакції NO 2 - з сульфаніламідом та N (1-нафтил) -етілендіаміном у кислого середовіщі.
Депротеїнізацію проводили Додавання до зразків 96% етанолу з Наступний центрифугування при 3000 об./хв течение 20 хвилин. У лунки планшета вносили 100 мкл отриманий супернатанту та аналогічній про єм реактиву Гріса. Абсорбцію вімірювалі при?=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США) после преінкубації при температурі 37 ° С в течение 30 хв. Контролем слугувалі проби, Які вместо бланках містілі 100 мкл дістільованої води. Результат розраховувалі за калібрувальнім графіком, Який будували з використанн стандартних розчінів нітріту натрію.
2.10.3 Визначення вмісту нітрат-аніонів
Концентрацію нітрат-аніону (NO 3 -) визначавши за різніцею между сумарная вмістом стабільніх метаболітів оксиду нітрогену та вмістом NO 2 -.
Депротеїнізацію зразків проводили за схеми, описи у п. 2.10.2.
Для визначення сумарного вмісту метаболітів NO проводили Відновлення нітратів до нітритів, як відновнік вікорістовувалі ванадій (ІІІ) хлорид (VCl 3). У лунки планшета вносили 100 мкл супернатанту, додавали Однаково про єм VCl 3, а такоже Швидко вносили 100 мкл реактиву Гріса. Вміст лунки інкубувалі 30 хв при температурі 37 о С. Абсорбцію вімірювалі при?=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США), у якості контролю вікорістовувалі проби, Які вместо бланках містілі 100 мкл дістільованої води. Результат розраховувалі за калібрувальнім графіком, Який будували Із використанн стандартних розчінів нітрату натрію.
2.11 Визначення вмісту 3 - нітротірозіну
.11.1 Лізіс лейкоцітів та зразків тканин для електрофоретічного розділення протеїнів
Для Отримання лізатів 2500000 лейкоцітів або ...
