лівках, в яких поживні речовини, pH і кисневий градієнт могли негативно впливати на експресію або фолдінг GFP. З недавніх пір для досліджень структури біоплівок використовують GFP-експресійний вектор, що містить гентаміціі-стійку касету для мічення штаму В. cenocepacia HI 11 (5. cepacia геномовар III).
Зміни в метаболізмі бактерій при їх переході до прикріпленого способу життя вивчалися шляхом порівняльного аналізу складу мРНК і білків в клітинах планктонних і біопленочних бактерій. Ці дослідження поряд з мікроскопічними спостереженнями дозволили описати різні стадії розвитку біоплівок, у тому числі їх прикріплення до субстрату, освіта мікроколоній і каналів, дозрівання біоплівок, а потім і дисперсію клітин.
Для виявлення ступеня відмінностей в експресії генів і, відповідно, в білкових складах клітин на різних стадіях розвитку біоплівки застосовують протеомних аналіз. При цьому вирощені бактерії після центрифугування і промивання для видалення середовища вирощування піддають одномерному електрофорез. Перевага одновимірного фореза полягає в тому, що білковий портрет культури виходить більш повним, ніж при двомірному, при якому обробка культури призводить до втрати деяких мембранних фракцій. Далі отримують протеомні карти допомогою двомірного гель електрофорезу і MALDI-TOF-мас-спектрометрії, заснованої на лазерній десорбції і іонізації макромолекул, опосередкованої матриксом і детекторами іонів, які дозволяють визначати час їх польоту.
У цьому методі імпульсне опромінення сорбенту, з яким пов'язані аналізовані макромолекули, призводить до їх ефективної фрагментації і десорбції в вакуум завдяки виборчому поглинанню сорбентом енергії світла. При цьому час польоту утворилися іонів в аналізаторі прямо пропорційно їх масі. Даний метод дозволяє проводити порівняльний аналіз білкових профілів різних мутантних штамів, що дає можливість визначити, який вплив досліджуваної мутації на експресію інших генів і на генетичний контроль досліджуваного процесу, в якому ці гени беруть участь. [10]
. 3 Методи виявлення біоплёнок
В даний час найбільш надійним методом підтвердження наявності мікробної біоплівки є спеціальна мікроскопія. У першу чергу це конфокальную лазерне сканирующее мікроскопічне дослідження. [12]
Принцип дії мікроскопа полягає в тому, що рефлексіруемое зображення, одержуване через об'єктиви в результаті заломлення по системі дзеркал, надходить на детектор, який обробляє приходять промені, складаючи зображення, передане на монітор комп'ютера. За допомогою руху лазерного променя відбувається пошарове сканування досліджуваного об'єкта. Зображення, що отримується на моніторі CLSM по відношенню до світлового мікроскопу, має дзеркальне відображення під кутом 90 °. [11]
Об'ємне зображення в LSCM виходить за допомогою реєстрації флуоресценції у фокусі лазерного променя. Випромінювані фотони фокусуються об'єктивом на невеликому отворі, яке послаблює флуоресцентний сигнал від ділянок, що знаходяться не у фокусі.
Застосування конфокальної скануючої лазерної мікроскопії для дослідження біоплівок радикально змінило сприйняття їх структурних та функціональних особливостей. Цей метод дав змогу дослідити біоплівки in situ без обмежень, з якими стикається електронна мікроскопія (технологія підготовки зразків приводила до їх обезводнення і руйнуванню, [10] хоча і при більш низьких збільшеннях. За допомогою конфокальної скануючої лазерної мікроскопії показано, що біоплівки - не структурним гомогенні моношари мікробних клітин на поверхні. Швидше вони можуть бути описані як гетерогенні в часі і в просторі структури, однак основна структура співтовариства універсальна, з деякими незначними варіаціями. [2]
Оцінити значення ЛСКМ в сучасних методах вивчення біоплёнок можна на прикладі роботи І.В. Чеботар з співавт. «Сучасні технології дослідження бактеріальних біоплёнок».
Об'єктом дослідження був придонний шар бульонной культури клінічного ізоляту коагулазопозітівного стафілокока.
Мікроскопічне дослідження проводили за допомогою лазерного скануючого (конфокального) мікроскопа LSM 510 Meta. Безпосередньо в чашці Петрі шар стафілококів фарбували флюорохромних барвниками. Отримані зображення реконструювали та аналізували за допомогою комп'ютерної програми ZeissLSM Image Browser. Візуалізація біоплівки за допомогою конфокальної виявила характерну для біоплівок тривимірну .Товщина дводобової біоплівки S. aureus коливалася від 20 до 47 мкм.
Окрема серія мікроскопічних досліджень рухливості біопленочних стафілококів (з аналогічною флюорохромних забарвленням) була проведена із застосуванням технології «резонансний сканер» на лазерному скануючому (конфокальному) мікроскопі TCS; зображення були віднов...
