лені за допомогою програмного забезпечення LAS AF Lite. Мікроскопічне спостереження за живою біоплівкою в режимі реального часу дозволило виявити особливий вид хаотичного (теплового) руху стафілококів, що знаходяться у її складі. Деякі стафілококи, будучи мікроскопічними частинками, вдавались до хаотичних коливання всередині обмеженого обсягу, порівнянного з їх розмірами. При цьому стафілококи могли не мати прямих контактів з сусідніми клітинами. На відміну від класичного броунівського руху переміщення стафілококів були обмежені. Це свідчило про те, що стафілококи механічно пов'язані між собою, і було непрямим підтвердженням існування необхідного атрибуту будь-якої біоплівки - позаклітинного матриксу, що зв'язує біопленочние мікроби між собою і з підлеглою поверхнею.
Для ультраструктурних досліджень рельєфу біоплівки використовували скануючий електронний мікроскоп JSM 6390А. Фіксацію препарату здійснювали при 4оС в два етапи. Спочатку проводили предфіксацію (30 хв) зразка в 2,5% розчині глутарового альдегіду (рН=7,2) з наступним триразовим відмиванням дистильованою водою. Потім препарат фіксували (30 хв) 0,5% розчином OsO4 з подальшим триразовим відмиванням в дистильованої воді. Після цього препарат кріофіксіровалі в рідкому азоті (- 196 ° С) і піддавали низькотемпературної дегідратації (- 100 ° С) у високому вакуумі протягом 24 ч. Після ліофілізації препарат монтували на тримач електронного мікроскопа і на його поверхню методом іонного розпилення в аргонової плазмі наносили шар платини (10 нм). Скануюча електронна мікроскопія проводилась при збільшенні від 1000 до 10000 разів. У просторовому розташуванні стафілококів простежувалися два рівні організації. Перший рівень пов'язаний з тим, що стафілококи формували кластери, що включають від 9 до 55 клітин. На більш високому рівні організації стафілококові кластери формували єдину надкластерную структуру, що складається з багатьох шарів, - біоплівку. Масив біоплівки пронизаний численними каналами, гирла яких відкривалися на зовнішню (досліджувану) поверхню біоплівки. Через просвіти каналів не видно підкладки, на якій сформувалася біоплівка. На 100 мкм2 поверхні біоплівки відкривається в середньому від 4 до 6 гирл каналів. В освіті стінок каналів у районі гирл беруть участь від 9 до 27 стафілококів. Між стафілококами спостерігалося два типи контактів: безпосередню взаємодію, за допомогою якого формуються кластери, і матрикс-опосередковані зв'язки. Останні виявлялися при збільшенні від 3000 до 15000: між окремими стафілококами існували незвичайні «перемички» - структури біопленочного матриксу, що зв'язують бактерії один з одним. Клітинна поверхню більшості стафілококів - рівною округлої форми, виключення становили ділянки клітинної поверхні, пов'язані з позаклітинним матриксом. Ця поверхня була нерівною, матрикс являв собою неструктуровану, неоформленную субстанцію. Слід зазначити, що біопленочний матрикс в умовах in vitro може бути утворений як активно секретується бактеріальними полімерами, так і дериватами клітин, отриманими в результаті аутолізу. [8]
Інші методи засновані на сорбції молекул барвника на структурах біоплівки, з подальшою їх відмиванням (десорбцією) в органічні розчинники. Такий спосіб індикації біоплівок найбільш часто використовується в статичних методах культивування мікробних біоплівок і дозволяє дати умовну кількісну характеристику утворився мікробним співтовариствам, тобто чим більше утворюється матрикс біоплівки, тим більше барвника сорбируется на його поверхні і тим вище оптична щільність зразка. [5]
Подібний метод був використаний в роботі Л. В. Лагун з співавт.
«Інтенсивність освіти мікробних біоплёнок мікроорганізмами, виделннимі при пієлонефритах і сечокам'яної хвороби»
У дослідженні використовували добові культури мікроорганізмів, вирощені на агарі Мюллера-Хінтона. Посіви інкубували в шейкері-інкубаторі при 37 ° С протягом 24 год, після чого бульйонну культуру обережно видаляли і вносили в пробірки 1 мл 0,1% водного розчину кристалічного фіолетового для фарбування сформованих біоплівок. Фарбування проводили при 37 ° С протягом 30 хв. Далі, повністю видаливши з пробірок розчин кристалічного фіолетового, проводили екстракцію барвника з біоплівки в 1 мл 96% етанолу протягом 1:00 при кімнатній температурі. [14]
Вимірювання біолюмінесценції (BPI) - досить новий метод вивчення і детекції біоплівок, який можна використовувати як in vitro, так і in vivo. При штучному введенні в бактерії плазмід, відповідальних за синтез люмінесцирующего білка, можна проводити візуалізацію як адгезірованних бактерій, так і матриксу біоплівки.
Метод флуоресцентної гібридизації in situ (FISH) також став порівняно недавно використовуватися для вивчення біоплівок в медицині (цей метод часто поєднується з методом CLSM). Метод гібридизації застосовують для...
