з високу пористості і схожості його будови з тканинами зуба. Надалі метод був стандартизований і в ньому стали використовувати полікарбонатні диски.
Суть методу полягає в наступному: на поверхню щільного поживного середовища поміщають диск, на який наносять суспензію досліджуваної культури. Живильні речовини надходять до клітин шляхом дифузії через пори полікарбонатного диска.
Таким чином, це єдиний з розроблених статичних методів, при якому до біоплівки поживні речовини надходять з щільного середовища. Цей метод рекомендується авторами досліджень як основний для виявлення впливу антимікробних речовин на формування
біоплівок.
Окремо слід вказати на метод, розроблений DE Kadouri з співавт., Який займає проміжне положення між статичними і динамічними методами. У методі використовуються 6-ямковий планшети, до кожній лунці яких підведена система подачі і відведення живильного середовища. Після певного часу інкубації, достатнього для адгезії бактерій на поверхні лунки, підключається система мікроциркуляції, яка забезпечує оптимальне надходження поживних речовин до формується біоплівки. [9]
. 2 Генетичні методи вивчення біоплёнок
Для виявлення генів, що беруть участь в генетичному контролі будь-якого процесу, використовуються методи спрямованого і ненаправленного (інсерційного) мутагенезу. Для з'ясування механізмів ініціації утворення біоплівок R. Kolter з співавт. описали мутанти, дефектні відносно утворення біоплівок, отримані за допомогою транспозони мутагенезу, у P. aeruginosa і Е. coli. При використанні даного методу спочатку отримують велику кількість инсерционно мутантних клонів і піддають їх тотальну перевірку на здатність до утворення біоплівок у порівнянні зі штамом, використовуваним як вихідного для мутагенезу.
У роботі J.J. Dennis і G.J. Zylstra в якості мігруючого генетичного елемента був використаний пласпозон - плазміда, до складу якої входить транспозон з антибіотико-стійкої касетою. Пласпозон здатний повністю вбудовуватися в будь-яке місце хромосоми, порушуючи послідовність гена і приводячи до инсерционно мутації в цьому гені.
Інсерція пласпозона в геном вихідного штаму може призвести до порушення роботи як генів, що кодують транскрипційні регулятори, так і будь-яких інших генів, і як наслідок - до посилення або зменшення здатності бактерій до утворення біоплівок. За допомогою цього методу була показана роль генів cepl-cepR в QS-регуляції у В. cepacia.
Інший підхід для вивчення генів, що контролюють розвиток біоплівок у P. aeruginosa, був використаний А. Finelli з співавт, які використовували систему дослідження генів, експрессіруемих у зрілій біоплівки. В основі методу лежить використання мутанта-ауксотрофамі з суворою живильної потребою, що дозволяє відбирати активні промотори в біоплівках, здатні відновити прототрофность у мутанта.
Для визначення факторів, що впливають на тривимірну структуру і, отже, на стійкість біоплівки до механічного пошкодження, індивідуальні клітки повинні бути позначені таким чином, щоб їх можна було візуалізувати із застосуванням епіфлюоресценціі або КСЛМ. Метод мічення включає приміщення послідовності ДНК, яка кодує флуоресцентну мітку, наприклад таку, як зелений флуоресцентний білок (green fluorescence protein - GFP), в хромосому бактерії за допомогою плазмідної вектора. Для флуоресценції GFP не вимагається будь-яких кофакторів або субстратів і, отже, можливе безпосереднє in vivo спостереження експресії GFP в індивідуальних клет?? ах, клітинних популяціях або навіть в цілих організмах у режимі реального часу. GFP і його аналоги являють собою виключно зручні білки-репортери для аналізу експресії генів.
Відомо, що инсерция в хромосому забезпечує стабільність у підтримці гена gfp, однак, при цьому існує ризик порушення нормальної генної експресії в області інсерції, оскільки ген gfp може вбудуватися в будь-яке місце в хромосомі. У цьому випадку gfp може бути використаний як репортерний ген.
Настільки ж ефективним, але менш руйнівним, є метод використання плазмідної експресійної вектора, безпечно забезпечує клітку геном флуоресцентного білка, який використовується в генно-інженерних конструкціях, що застосовуються для дослідження експресії генів в живих тканинах і мікроорганізмах in vivo (наприклад, при ідентифікації бактеріальних генів за допомогою методу заміни генів - gene replacement).
У літературі описано безліч подібних GFP експресійних векторів, однак лише кілька з них застосовні для використання в изолятах комплексу В. cepacia. M.D. Levebre і М.А. Valvano описали нові GFP-вектори для дослідження регуляції генної експресії у В. cenocepacia, але вони не були протестовані для використання в біоп...
