бувається Транскрипційні злиття між його промотором і lacZ геном-репортером. Якщо даний ген є частиною оперона, то інші дистально розташовані гени виявляються під контролем промотора P spac . При цьому термінатор l, розташований перед P spac запобігає транскрибування цих генів з інших проксимально розташованих промоторів. Дані маніпуляції призводять до утворення відразу двох типів мутантів: нульових мутантів (за orf2 ) у результаті розриву гена і умовних мутантів (за orf3 ) залежних від IPTG. <В
Рис. 9. Інтеграція pMUTIN в досліджуваний ген. Гени оперона orf1-orf3 показані у вигляді білих боксів. Заштрихований ген відповідає внутрішньому сегменту досліджуваного гена. Вектор інтегрується в orf2 шляхом одиночного кросинговеру. Стрілки позначають напрямок транскрипції, зламані стрілки позначають промотор оперона і P spac .
Створені вектори для проведення інсерційного мутагенезу у штамах виду Bacillus cereus , заснованого на вбудовуванні мобільного елемента IS231A у випадкові сайти хромосоми бактерії (Leonard et al., 1998). Створені вектори pGIC055 і pGIC057 являють собою версії однієї плазміди і побудовані на основі термочутливого реплікону pHT1030. У своєму складі вони мають:
1) mini-IS231A, що включає в себе селективний маркер (Стійкість до канаміцину [pGIC057] або спектиноміцину [pGIC055]) і полілінкерамі між інвертованими повторами;
2) ген транспозази IS 231 A (TnA), що знаходиться під контролем сильного промотора P deg;
3) додатковий маркер-ген стійкості до еритроміцину. p> транспозиція mini-IS231A з плазмід pGIC055 або pGIC057 в хромосому здійснювали при температурі 28 В° С. Плазміди потім елімінувати шляхом підвищення температури культивування до 46 В° С. З'ясувалося, що в хромосомі Bacillus cereus є один сайт сильно переважний для транспозиції mini-IS231A (лівий інвертований повтор транспозона Tn4430). Якщо в даний сайт вже здійснена вставка, наступні вставки здійснюються у випадкові сайти. p> Шляхом повторної вставки були отримані ряд ауксотрофності мутантів. З використанням рестрикционного аналізу дані мутації (Також як і переважний для транспозиції сайт) були локалізовані на мапі хромосоми B. cereus .
В
Рис. 10. Структура векторів pGIC055 і pGIC057. ori - реплікативний регіон pHT1030; TnpA - ген транспозази; MCS 2 - полілінкерамі; P deg - місцями промотор; інвертовані повтори позначені чорними трикутниками; детермінанти стійкості: Em R - до еритроміцину, mini-IS - до спектиноміцину (pGIC055) або канаміцину (pGIC057).
З мутанта ауксотрофності по аденіну була вирізана вставка mini-IS231A разом з прилеглими ділянками шляхом рестрикції Eco RI (у mini-IS сайт для даної рестриктази відсутня). Шляхом секвенування та порівняння з послідовностями з баз даних було виявлено, що сайт, ...
