в який була здійснена вставка, має високий ступінь гомології з генами pur оперона B. subtilis , що може вказувати на те, що вставка mini-IS231A сталася в один з генів синтезу пуринів. Дані результати показують, що рестрикційний аналіз разом з секвенуванням дозволяють створювати об'єднані фізичні та генетичні карти бактеріальної хромосоми B. cereus .
Дану систему можна використовувати для проведення інсерційного мутагенезу також в інших грампозитивних бактеріях, здатних рости при температурі вище 45 В°.
У геномі B. cereus (як і в більшості інших про-і еукаріотичних геномів) відсутня сайт рестрикції I- Sce I. Даний сайт присутній в полілінкерамі mini-IS. Тому послідовне введення двох mini-IS, несучих два різних маркера резистентності, в хромосому призводить до отриманню фрагмента обмеженого двома сайтами I- Sce I. Таким чином, шляхом рестрикції I- Sce I можна отримувати фрагменти, відповідні для секвенування. Даний метод дозволяє уникнути ряду труднощів зустрічаються при використанні традиційних методик клонування. br/>
1.6. Вектори для отримання гібридних білків
В
B. subtilis довгий час вивчається як зразок простий клітинної диференціювання тому при голодуванні у неї запускається програма диференціальної експресії генів звана споруляцию. Вивчення споруляции у свою чергу призвели дослідженню процесів що відбуваються протягом клітинного циклу, зокрема клітинного ділення, сегрегації хромосом і синтезу макромолекул. У проведенні цих досліджень важливу роль відіграє використання зеленого флуоресцентного білка GFP (green fluorescent protein), вживаного в якості цитологічного маркера.
Злиття кодує його гена gfp з іншими генами дозволяє отримувати гібридні білки, локалізацію яких можна простежити в живих клітинах. Для цієї мети було розроблено ряд векторів (Lewis PJ, Marston, 1999; Feucht A., Lewis, 2001; Kaltwasser et al., 2002). p> Була сконструйована серія векторів, що несуть різні варіанти гена gfp : gfpmutI (pSG1151, pSG1164, pSG1154, pSG1729) і gfpuv (pSG1156, pSG1170) (Lewis PJ, Marston, 1999; ріс.11a, опис нижче). Продукти даних генів (GFPmut1 і GFPuv) представляють собою мутантні білки, володіють порівняно c природним GFP більшою яскравістю і різняться по спектру випромінювання. Останнє властивість дозволяє паралельно простежити локалізацію в одній клітці молекул двох типів білків зшитих з різними формами GFP (тобто проводити подвійне мічення клітин).
Вектори pSG1151 і pSG1156 (ріс.11a). При використанні цих векторів ділянка гена, що кодує С-кінцевий фрагмент досліджуваного білка, вставляється перед gfp . У результаті інтеграції в хромосому шляхом одиночного кросинговеру відбувається злиття gfp з потрібним геном і гібридний білок експресується з промотора даного гена. Проксимальнее вставленого вектора буд...
