ахунку в камері Горяєва.
кров людина гранулярний поліморфноядерними
2.3 Визначення активності мієлопероксидази поліморфноядерних гранулоцитів у спонтанному тесті
Безпосередньо перед експериментами готувалися розведення клітинної суспензії нейтрофілів в концентраціях: 100, 200, 300 і 400 тисяч клітин в пробі.
Як субстрат використовували свіжоприготовану суміш наступного складу: ортофенілендіамін (0,04%), перекис водню (0,002%) на 0,1 М фосфатно-цитратному буфері (pH = 4,5).
.3.1 Визначення спонтанної активності мієлопероксидази поліморфноядерних гранулоцитів за допомогою твердофазного методу
Аліквоти клітинної суспензії 100 мкл (у концентрації 100, 200, 300 і 400 тис. клітин в пробі) поміщали в лунки плоскодонного 96-ямкового планшета, інкубували протягом 60 хвилин при 37 Вє С, потім клітинну суспензію видаляли і лунки тричі промивали робочим буфером. Потім у кожну лунку вносили свіжоприготовану субстратную суміш в обсязі 200 мкл і інкубували при 37? З 15 хвилин. Зупинку реакції виробляли додаванням 10% сірчаної кислоти. Результати оцінювали спектрофотометрично при довжині хвилі 492 нм. br/>
.3.2 Визначення активності мієлопероксидази в клітинному лізаті поліморфноядерних гранулоцитів
У пробірки для мікроаналізу вносили 200 мкл суспензії нейтрофілів (в концентрації 100, 200, 300 і 400 тис. клітин в пробі), додавали рівний об'єм дистильованої води і інкубували при 37? С протягом 1 години. Потім в кожну пробірку вносили свіжоприготовану субстратную суміш і інкубували при 37? З 15 хвилин. Зупинку реакції виробляли додаванням 10% сірчаної кислоти, потім центрифугували 15 хв. при 2000 об/хв.
Результати оцінювали спектрофотометрично при довжині хвилі 492 нм.
.3.3 Визначення активності мієлопероксидази поліморфноядерних гранулоцитів за допомогою спонтанного тесту в розчині (модифікований метод)
При проведенні спонтанного тесту інтактні нейтрофіли вносили в пробірки для мікроаналізу в обсязі 200 мкл (у концентрації 100, 200, 300 і 400 тис. клітин в пробі), потім додавали 200 мкл субстратної суміші, що з ортофенілендіамін (0,04%) і 0,002% перекису водню в 0.1м фосфатно-цитратному буфері, pH = 4,5. Через 15 хв реакцію зупиняли додаванням 200 мкл 10% сірчаної кислоти., Потім проби центрифугували 15 хв. при 2000 об/хв.
Результати оцінювалися спектрофотометрично при довжині хвилі 492 нм.
.4 Статистична обробка результатів
Статистична обробка отриманих експериментальних даних проводилася з використанням пакету програм Statistica 6.0. Оцінка достовірності отриманих результатів, що не підкоряються закону нормального розподілу, проводилася з використанням непараметричних ме...
