,2-7,4), що включає 4 мл 1% розчину MnCl2. Моношар клітин разом з розчином ЙНТ інкубується при 37 В° С протягом 30 хв, після чого надосадок видаляється, моношар клітин двічі відмивається розчином Хенкса і висушується. Розташовані внутрішньоклітинно гранули діформазана розчиняють 100 мкл ізопропілового спирту, підкисленого 0,04 М HCl, протягом 20 хв. Оптична щільність розчину визначається на мікроплатном рейдері при довжині хвилі 492 нм. p align="justify">) Визначення активності сукцинатдегідрогенази
Визначення активності ферменту проводиться в МТТ-тесті, де в якості субстрату використовується 3 - (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метілтіазолілтетразолій бромід, МТТ, виробництва ICN) . В лунки до фіксованих клітинам додається по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основі 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), що включає 4 мл 1% розчину MnCl2. Моношар клітин разом з розчином МТТ інкубується при 37 В° С протягом 30 хв, після чого надосадок видаляється, моношар клітин двічі відмивається розчином Хенкса і висушується на повітрі. Для підрахунку гранул броміду діформазана клітини руйнуються додаванням 100 мкл ізопропілового спирту, підкисленого 0,4 М HCl. Оптична щільність визначається на мікроплатном рейдері при довжині хвилі 540 нм. Реакції ставляться в триплетах лунок плоскодонного 96-ямкового планшета з не стимульований і стимульований клітинами. Оптичну щільність розчину вимірюють на мікропроцесорі Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") При відповідній для кожного ферменту довжині хвилі [16]. br/>
2. Матеріали і методи дослідження
.1 Використані матеріали
У роботі були використані наступні реактиви: хлорид натрію NaCl (В«П'ять океанівВ», м. Мінськ, хч), хлорид калію KCl (В«П'ять океанівВ», м.Мінськ, хч), гідрофосфат натрію NaH2PO4 (В«П'ять океанівВ», м.Мінськ, хч), глюкоза, фіколл-урографін (В«SigmaВ», Німеччина, хч), барвник Романовського-Гимзи (В«МінімедВ», м. Брянськ), оцтова кислота (В«ЛавернаВ», м . Москва, хч).
В якості основного буферного розчину використовували 10мм калій-натрій фосфатний буфер, що містить 140мм NaCl, 10мм KCl, 10мм NaH2PO4, 5мм глюкози; рН 7,3, а також 0,1 М натрій-цитратний буфер, рН 4,5.
.2 Отримання поліморфноядерних гранулоцитів з периферичної крові
В експериментах була використана кров п'ятнадцяти здорових донорів.
Для отримання нейтрофілів до цільної венозної крові додавали рівний об'єм робочого буфера, потім нашаровується на градієнт фіколл-урографіну (? = 1,085/1,18) < span align = "justify"> у співвідношенні обсягів 2:1, центрифугували 30 хвилин при 2000 об/хв, після чого відбирали утворився шар лейкоцитів. До виділеної клітинної суспензії додавали 10мм К, Na-фосфатний буфер. Концентрацію лейкоцитів визначали шляхом підр...
