ділена по протоколу № 1 лужного методу. З кожного препарату ДНК були приготовлені розведення 1:5 і 1:20, які потім тестувалися в контрольній ПЛР. За результатами ПЛР оцінювалася кількість і якість ДНК, вибиралося найкраще для подальшого тестування розведення ДНК. Результати наведені в таблиці 6.
Таблиця 6. Результати контрольної ПЛР ДНК, виділеної лужним методом.
номер образцаdCt=Ct зразка-Ct плаценти (лужний метод) 1не визначається, dCt> 202-1,132,8415 Чи не визначається, dCt> 206-0,171,68 Чи не визначається, dCt> 2091,710 Чи не визначається, dCt> 20115,212 Чи не визначається, dCt> 20
З таблиці 6 видно, що у 5 з 12 препаратів ДНК величина Ct не визначається, що може бути пов'язано з низьким вмістом ДНК в реакційній суміші або присутністю великої кількості інгібіторів. У зв'язку з цим препарати ДНК були очищені на колонках з сорбентом Qiagen і знову протестовані в контрольній ПЛР.
Паралельно були приготовлені ще по 2 зрізу кожного парафінового блоку зразка тканини. З цих зрізів ДНК виділялася по протоколу до набору MagneSil Genomic, Fixed System (Promega, product MD 1490). Були отримані препарати ДНК, з яких були приготовлені розведення 1:5 і 1:20 і протестовані в контрольній ПЛР. Порівняльні величини dCt=Ct зразка-Ct плаценти ДНК, виділеної різними методами, показані на малюнку 8.
Рис. 8. Гістограма величин dCt ДНК, виділеної різними методами.
Лужний метод дозволив отримати ДНК з dCt в інтервалі - 3? dCt? 3 у зразків № 2, 3, 4, 6, 7, 9 пухлинної тканини з 12. Після очищення препаратів ДНК на колонках Qiagen тільки один зразок № 2 мав dCt в інтервалі - 3? dCt? 3, але dCt 2 Qiagen> dCt 2 лужний метод. Препарати ДНК, отримані за допомогою набору Promega, із зразків № 1, 2, 3 мали dCt в інтервалі - 3? DCt? 3. Таким чином, лужної метод допоміг отримати препарати ДНК з оптимальною кількістю ДНК у 5 з 12 зразків тканини. Подальша очищення ДНК на колонках Qiagen неполіпшила результати ПЛР у жодного із зразків.
Детекція мутацій в гені KRAS в парафінових зрізах фіксованою тканини колоректального раку
На наявність мутацій в гені KRAS було протестовано 10 зразків. ДНК зразків була виділена з відповідних парафінових зрізів лужним методом. Для нормировки тесту була проведена контрольна ПЛР на константних район гена KRAS з кожним препаратом ДНК. Далі ДНК тестувалася в ПЛР з аллель-специфічними праймерами на мутації 12 і 13 кодонів. Паралельно тестувався позитивний стандарт, що містить 5% ДНК, в якій ген KRAS містить мутацію. Підраховували dCt за формулою dCt=Ct мут - Ct контр. Зразок вважався позитивним (що містить мутацію), якщо dCt зразка дорівнює або менше dCt позитивного стандарту. Зразок є негативним (без мутації або утримання мутації менше 5%), якщо dCt зразка більше dCt стандарту.
Результати аналізу зразків на 7 мутацій а гені KRAS представлені в таблиці 7.
Таблиця 7. Результати аналізу на мутації в гені KRAS.
Зразок № KRAS - 7М (Біолінк) 1Gly12Val2Нет мутацій3Gly12Ser4Нет мутацій5Gly12Cys6Нет мутацій7G12D8Нет мутацій9Нет мутацій10G12D
Таким чином 5 зразків з 10 не містять мутацій в гені KRAS, 2 зразки містять мутацію G12D, 1 - G12V, 1 - G12S, 1 - G12C.
