) тестування препаратів ДНК в контрольній ПЛР в режимі реального часу;
) аналіз результатів ПЛР.
За 2 зрізу одного парафинового блоку поміщали в дві 1.5 мл пробірки. Зрізи з однієї пробірки оброблялися відповідно до протоколу до набору Qiagen, з іншого - протоколу № 1 лужного методу виділення. В результаті чого були отримані розчини ДНК кожного зразка. Готували розведення ДНК 1:5 і 1:20, які потім тестувалися в контрольній ПЛР до константностей ділянці гена KRAS. Для порівняння тестувалися контрольна ДНК плаценти людини без мутацій з концентрацією 1нг/мкл. Кількість циклів ПЛР, необхідних, щоб флуоресценція перевищила рівень фону, називається Ct. Для кожного препарату ДНК визначали розведення, яке дає величину Ct, найбільш близьку до контрольної ДНК. За величиною Ct в контрольній ПЛР визначали придатність індивідуальних зразків для тесту на мутації в гені KRAS. Зразок ДНК вважався придатним для подальшої роботи, якщо Ct зразка=Ct плаценти ± 3. Таким чином оцінювалася кількість ДНК в препараті (чим більше Ct зразка щодо Ct плаценти, тим менше міститься ДНК в препараті). Якість ДНК препарату оцінювалося по нахилу кривої флуоресценції щодо кривої, що відповідає ДНК плаценти.
На рис. 6 наведені результати ПЛР у реальному часі з детекцією флуоресценції SybrGreen. ДНК зразка має Ct зразка=15,45, Ct плаценти=12,94. Таким чином Ct зразка-Ct плаценти=2,51, отже кількість ДНК в препараті прийнятне для подальшого тестування.
Рис. 6. Контрольна ПЛР на константних район гена KRAS. Зелена лінія - рівень фону, синя лінія - ДНК плаценти, червона лінія - ДНК зразка пухлини МКРР.
Для коректності результату всі зразки тестували в дублях.
Після тестування препаратів ДНК в контрольній ПЛР для кожного зразка було вибрано підходяще для подальшого тестування розведення. Отримані величини Ct за двома методами виділення ДНК наведені на рис.7.
Рис. 7. Гістограма результатів ПЛР ДНК зразків, виділених за протоколом Qiagen і лужним методом.
Середня величина Ct для ДНК, виділених за протоколом Qiagen склала 17,2, Ct для ДНК, виділених лужним методом - 15,6. Різниця між Ct qiagen і Ct щел. метод дорівнює 1,6, значить при виділенні ДНК лужним методом кількість ДНК в препараті в середньому в3 рази більше, ніж при виділенні по протоколу Qiagen.
Переваги та недоліки виділення ДНК по протоколу Qiagen і лужним методом зведені у таблиці 5.
Таблиця 5. Порівняння двох методів виділення ДНК з парафінових зрізів по різних параметрах.
ПараметрВиделеніе ДНК по протоколу QiagenВиделеніе ДНК лужним методомВиход ДНКВ 3 рази більше, ніж за протоколом QiagenВремя теста24-48 часов2-3 часаСтоімость 200-360 руб. / тест близько 10-15 руб. / тест
Таким чином, можна зробити висновок, що лужний метод виділення ДНК з парафінових зрізів має більше переваг: кількість отриманої ДНК придатне для тестування на мутації в гені KRAS, має низьку вартість і займає менше часу.
Порівняльний аналіз результатів тестування ДНК «складних» зразків, виділеної різними способами
У роботі використовувалося 12 зразків. З них були приготовлені зрізи, ДНК з яких була ви...
