преадсорбірованимі антитілами вносять по 50 мкл досліджуваного розчину або стандартних розведень антигену. Розведення антигену повинні бути приготовані на основі PBST, оскільки Tween - 20 знижує неспецифічне зв'язування білкових молекул один з одним і з поверхнею планшета. І досліджуваний розчин, і стандартні розведення антигену вносять попарно (або по 3 повторності), використовуючи по два (три) лунки на кожне розведення білка. Інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв при постійному перемішуванні.
Відмивання здійснюється розчином PBST 3 рази.
. Інкубація з антитілами, кон'югованими з ферментної міткою
В лунки планшета вносять по 100 мкл розчину специфічних антитіл, кон'югованих з ферментної міткою. Оптимальна концентрація кон'югованих антитіл як правило вказується виробником (зазвичай використовують концентрацію 2-4 мкг / мл). Інкубація з антитілами, що містять ферментну мітку, проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.
. Проведення ферментативної реакції, що супроводжується появою забарвленого продукту
В лунки вносять по 100 мкл розчину субстрату і інкубують протягом 10 хв при кімнатній температурі і постійному перемішуванні.
6. Зупинка ферментативної реакції Перед вимірюванням оптичної щільності проводять зупинку кольорової реакції за допомогою 0.5 М Н2SО4.В лунки з робочим розчином ОФД після інкубації вносять по 50 мкл розчину 0.5 М сірчаної кислоти. Після цього можна відразу приступати до вимірювання оптичної щільності.
. Вимірювання оптичної щільності
Оптична щільність розчину забарвленого продукту вимірюється при? =490 нм з використанням планшетного спектрофотометра.
Постановка ПЛР:
Загальний обсяг реакції - 25 мкл, об'єм ДНК-проби - 10 мкл. Проводиться в ЗОНІ 2 - кімнаті для підготовки та проведення ПЛР-ампліфікації.
Необхідне обладнання:
. Ампліфікатор (наприклад, «Терцик» (ДНК - технологія); «GeneAmpPCRSystem 2400», «GeneAmpPCRSystem 2700» (AppliedBiosystems); «GradientPalmCycler» (CorbettResearch); «Biometra».
. ПЛР-бокс
. Мікроцентрифуга
. Окремий набір автоматичних піпеток змінного об'єму (5-40 мкл, 40-200 мкл).
. Штативи «робоче місце» для мікропробірок на 0,5 мл.
. Одноразові мікропробірки для ПЛР на 0,5 мл або 0,2 мл.
. Одноразові наконечники до 100 мкл з фільтрами в штативах для автоматичних піпеток з перемінним обсягом.
. Окремий халат і одноразові рукавички.
. Ємність для скидання наконечників.
. Холодильник на 2 - 8 ° С; морозильник на мінус 20 ° С для зберігання виділеної ДНК.
Необхідні реактиви
Таблиця 2. Комплект «АмпліСенс»
РеактівАмпліСенс - 100 - RОб'ем (мл) Кількість (шт.) ПЛР-суміш - 1 * 0,005110 ПЛР-суміш - 21,11 Мінеральне масло для ПЦР4, 01ДНК-буфер1, 01Рассчітан на 110 реакцій * - ПЛР-суміш - 1 поміщена під віск
Таблиця 3. Контро...
