льні зразки
РеактівОб'ем (мл) Кількість (шт.) ПКО ДНК (позитивний контрольний зразок ДНК) 0,11 ДНК-буфер (буфер для розведення та зберігання ДНК) 1,01
У всіх наборах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується" гарячий старт", який забезпечується поділом нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при установці пробірок в ампліфікатор, нагрітий до 950С, що значно знижує кількість неспецифически зацькованих реакцій.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР:
. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю - 1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.
. Внести по 10 мкл ПЛР-суміші - 2, при цьому вона не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю - 1.
. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 15-25 мкл).
. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з фільтрами внести по 10 мкл ДНК, виділеної з клінічних проб або контролів етапу виділення.
. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР (див. нижче):
а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;
б) позитивний контроль (К +) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК (ПКО);
. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. табл.).
Програми ампліфікації ДНК збудників інфекцій, що передаються статевим шляхом.
. Коли температура в осередку ампліфікатора досягне 95 ° С, помістити пробірки в осередки ампліфікатора, закрити кришку приладу і зняти програму з паузи.
. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (ЗОНУ 3). Проби після ампліфікації можна зберігати протягом 16 годин при кімнатній температурі, до одного тижня при 2-8 ° С і тривало при мінус 20 ° С (однак перед проведенням електрофорезу необхідно нагріти пробірки до кімнатної температури для розм'якшення воску). Аналіз продуктів ампліфікації проводиться поділом фрагментів ДНК в агарозному гелі. Іммуноблотінга - сучасний високочутливий аналітичний метод, який використовується для визначення в зразку специфічних білків за допомогою антітел.Ідентіфікація досліджуваного білка (наприклад, онкобелкі тощо) у складних сумішах або екстрактах різних тканин є однією з часто зустрічаються завдань. Використовуючи такий інструмент як специфічні антитіла, можна визначити досліджуваний білок з мінімумом тимчасових і фінансових витрат. Імуноблоттінг використовується в молекулярній біології, біохімії, генетіке.Метод заснований на комбінації гель-електрофорезу і імунохімічної реакції «антиген-антитіло».
За допомогою гель-електрофорезу білки поділяються в поліакриламідному гелі. Далі білки переносять на нітроцелюлозну або PVDF мембрану. Потім їх детектируют з використанням антитіл методом «сендвіча»: спочатку білки зв'язуються з первинними (моно-або поліклональних) антитілами, які в свою чергу зв'язуються з вторинними антитілами, кон'югованими з ферментами (пероксидазою хрону або лужною фосфатазою). Візуалізація досліджуваного білка досягається шляхом проведення відповідної біохім...
