justify">. Додавання антивидових антитіл, кон'югованих з ферментної міткою
В якості детекторних (вторинних) антитіл використовуються антівідовиеполіклональние антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону. Найчастіше використовуються козячі або кролячі антитіла, специфічні до цілої молекулі або до Fc-фрагментами специфічних антитіл. Концентрація детекторних антитіл як правило вказується виробником у вигляді розведення вихідного розчину (наприклад, 1:1000).
Інкубація з вторинними антитілами проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетов.Отмивка здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.
Пероксидаза хрону каталізує реакцію окислення субстрату перекисом водню. Як субстрат пероксидази хрону використовується о-фенілендіамін (ОФД). У результаті проходження реакції утворюється забарвлений продукт окислення ОФД. Розчин субстрату: До 10 мл субстратного буфера (0.1 М Na-цитратний буфер, рН 4.5) додати 0.01 мл 30% перекису водню і 0.2 мл 50х розчину ОФД (340 мг ОФД в 10 мл етилового спирту; зберігати при - 20 ° С). інкубація проводиться протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. . Зупинка ферментативної реакції
Перед вимірюванням оптичної щільності проводять зупинку кольорової реакції за допомогою 0.5 М Н2SО4.В лунки з робочим розчином ОФД після інкубації вносять по 50 мкл розчину 0.5 М сірчаної кислоти. Після цього можна відразу приступати до вимірювання оптичної щільності.
. Вимірювання оптичної щільності
Оптична щільність розчину забарвленого продукту вимірюється при? =490 нм з використанням планшетного спектрофотометра.
Прямий імуноферментний аналіз:
Методика прямого иммуноанализа має лише невеликі відмінності в порівнянні з методикою непрямого иммуноанализа. Так, стадії 1 і 2 однакові в обох типах аналізу. Відмінність полягає в тому, що в прямому варіанті иммуноанализа на стадії 3 використовують специфічні антитіла, кон'юговані з ферментної міткою. При необхідності також можна проводити растітровку специфічних антитіл, кон'югованих з ферментної міткою, аналогічно описаному раніше для некон'югованих антитіл. Стадія 4 опускається, а подальші стадії (5-7) проводяться аналогічно описаному вище для непрямого варіанту иммуноанализа.
іммуноаналіз сендвіч-типу:
У даному варіанті иммуноанализа використовується пара антитіл, специфічних до просторово удаленнимепітопам досліджуваного антигену.
. Сорбція антитіл підкладки
В лунки 96-лункового планшета для проведення иммуноанализа сорбували антитіла підкладки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.
Відмивання (2-х кратна) несвязавшихся молекул антигену здійснюється фосфатно-сольовим буфером містить 0.1% Tween - 20 (PBSТ).
. Блокування
Для блокування місць неспецифічного зв'язування лунки планшета заповнюють PBST і інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі.
. Інкубація з антигеном
В лунки планшета з ...
