одезоксінуклеотіда, реакційну суміш перемішували і центрифугували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин з круговою частотою, рівній 12500 об/хв.
Після цього в реакційну суміш вносили 1/4 розрахованого об'єму розчину цітавлона, повторювали перемішування і центрифугування.
Аналогічні дії виконували і при додаванні 1/6 розрахованого об'єму розчину цітавлона.
Після останнього центрифугування супернатант відкидали, а до осаду добавлялоі 100 мкл метанолу.
Метанол випарювали на вакуумному випарнику, отриману сіль олігонуклеотиду висушували над P 2 O 5 в вакуумованому ексикаторі.
2.7 Отримання біспіренілного похідного олігонуклеотиду
Кон'югати отримували згідно модифікованою методикою [30]
Активація. Реакційна суміш містила 1 - 4 о.е. (5 - 20 нмоль) цітавлоновой солі олігодезоксірібонуклеотда і по 10 мг висушених DMAP, PPh 3 і (PyS) 2 . Активацію 5 -кінцевого фосфату проводили таким чином: спочатку 4 рази повторювали термостатування при 50 Вє С протягом 1 - 1,5 хв і подальше інтенсивне перемішування протягом 5 - 10 с, потім інкубували при 37 Вє С протягом 15 хв.
Кон'югація. До розчину олігонуклеотиду з активованим 5 -кінцевим фосфатом додавали піренілметіламін (2 мг), висушений в ексикаторі над P < span align = "justify"> 2 O 5 під вакуумом. Реакційна суміш безперервно перемішували протягом 2 годин при 56 Вє С.
Виділення продукту. Продукти облягали з розчину 1,2 мл діетилового ефіру, розчиняли в 50 мкл 3 М водного розчину перхлорату літію, переосаждалі 1,2 мл суміші діетилового ефіру і 2% розчину перхлорату літію в ацетоні (1:1) і розчиняли в 50 мкл води. Суміш продуктів реакції розділяли за допомогою звернено-фазової хроматографії в градієнті ацетонітрилу (див. 2.4). Фракції аналізували методом затримки в гелі за допомогою електрофорезу в ПААГ в денатуруючих умовах.
2.8 Виділення сумарної РНК з клітин
Виділення РНК з суспензії клітин здійснювали методом хлороформ-фенольної екстракції і за допомогою набору В...
