«Gen Elute в„ў Mammalian Total RNA KitВ» фірми В«SigmaВ» (США).
2.8.1 Виділення сумарної РНК методом хлороформ-фенольної екстракції
Суспензію клітин центрифугували при 4 Вє З з круговою частотою 1000 об/хв протягом 10 хв. Супернатант відкидали, до осаду клітин додавали 500 мкл буфера PBS, отриману суспензію центрифугували при 4 Вє З з круговою частотою 1000 об/хв протягом 10 хв. До осаду додавали буфер для лізису з розрахунку 200 мкл/10 6 клітин і інкубували в льоду протягом 13 хв. Потім суспензію центрифугували при 4 Вє З з круговою частотою 13000 об/хв протягом 10 хв, осад відкидали. До отриманого розчину додавали десяту частину його об'єму розчину ацетату натрію з pH = 4,2. Двічі проводили фенольну екстракцію і один раз - екстракцію сумішшю фенолу і хлороворма в об'ємному відношенні 1:1, кожен рас відкидаючи органічну фазу. РНК із суміші облягали потрійним об'ємним надлишком етанолу в присутності 0,3 М ацетату амонію протягом доби при - 20 Вє С. Обложену РНК розчиняли в 50 мкл води. Якість виділеної РНК перевіряли ставленням оптичної щільності на довжинах хвиль 260 і 280 нм і поділом методом електрофорезу в агарозному гелі.
2.8.2 Виділення сумарної РНК за допомогою набору В«Gen Elute в„ў Mammalian Total RNA KitВ» фірми В«SigmaВ»
Виділення РНК проводили згідно з методикою, що додається розробниками до набору.
Суспензію клітин центрифугували при кімнатній температурі з круговою частотою 800 об/хв протягом 3 хв, до осаду клітин додавали 5 мкл меркаптоетанол і 245 мкл В«Lysis SolutionВ». Суспензію фільтрували у колонці для фільтрування (Filtration Column), до фільтрували Лізати додавали 250 мкл 70% водного етанолу. Лізат у колонці для фільтрації при центрифугировании при максимальній круговій частоті протягом 15 с, матковий розчин відкидається. Осад промивається 500 мкл розчинів для промивання при центрифугировании при максимальній круговій частоті протягом 15 с: спочатку Wash Solution 1, потім Wash Solution 2; матковий розчин щоразу відкидається. РНК з колонки елююють 50 мкл води. Якість виділеної РНК перевіряли ставленням оптичної щільності на довжинах хвиль 260 і 280 нм (оптимальне відношення 1,8) і поділом методом електрофорезу в агарозному гелі. Якість виділеної РНК перевіряли ставленням оптичної щільності на довжинах хвиль 260 і 280 нм і поділом методом електрофорезу в агарозному гелі. br/>
2.9 Отримання кДНК за допомогою реакції зворотної транскрипції
Зразок РНК піддавали гідролізу ДНКаза I для очищення в...
