pan align="justify"> HCl, pH = 8,3; 3 мM MgCl2; 75 мМ KClБуфер для ПЦР10 мМ Tris HCl, pH = 8,3; 1,5 Мm MgCl2; 50 мМ KCl; 0,01% Tween-20Буфер для лізіса5 мМ Tris HCl, pH 7.8; 0,1% Nonidet P-40; 1 мM ЕДТАPBS10 мM Na2HPO4; 2мМ KH2PO4; 0,15 M KCl; 0,14 M NaCl
2.4 Розділення олігонуклеотидів за допомогою ВЕРХ
ВЕРХ проводили на хроматографі В«Waters 2996В», на колонці довжиною 150 мм з звернуто-фазовим сорбентом Symmetry В® C 18 з діаметром мікрочастинок 5 мкм, в лінійному градієнті ацетонітрилу у воді (0 - 30%) у присутності 50 мМ LiCLO 4 ; швидкість потоку 1 мл/хв.
2.5 Електрофорез нуклеїнових кислот
2.5.1 Електрофорез нуклеїнових кислот у ПААГ в денатуруючих умов
В експериментах для раздененія реакційних сумішей і аналізу зміні рухливості олігонуклеотиду при кон'югації з лігандом використовували електрофорез в 12%, 16% і 18% поліакриламідному гелі (GFFU) при масовому співвідношенні N, N'-метіленбісакріламід/акриламід 20:1 у присутності 8 М сечовини і 1-кратного буфера TBE при напруженості електричного поля 15 - 45 В/см. При аналізі олігонуклеотидів і їх піренільних похідних гель фарбували в розчині В«Stains-AllВ» (0,5 г барвника В«Stains-AllВ» в 200 мл 50% водного формамід) протягом 10 хвилин у темряві. Знебарвлення гелю проводили у воді на яскравому світлі. p align="justify"> 2.5.2 Електрофорез нуклеїнових кислот у агарозному гелі
Поділ фрагментів ДНК - продуктів ПЛР, проводили за допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі в присутності 1-кратного буфера TBE і 0,002% (об'.) бромистого етидію при кімнатній температурі і напруженості електричного поля 5 - 10 В/см. Візуалізацію ПЛР продуктів проводили на трансіллюмінаторе за рахунок розгоряння флюоресценції молекул бромистого етидію при інтеркаляції дцДНК. br/>
2.6 Приготування цітавлонових солей олигонуклеотидов
Для отримання цітавлонових солей олігонуклеотиду готували розчин, що містить 1 - 6,5 о.е. олігодезоксірібонуклеотіди в 90 мкл води. Розрахунок додається в реакційну суміш 2% водного розчину цітавлона виробляли з урахуванням 2,5-кратного надлишку цітавлона по відношенню до сумарної кількості атомів фосфору в складі 5 -кінцевого фосфату і фосфодіефірних зв'язків олігодезоксірібонуклеотіди. Розчин цітавлона додавали порціями, причому після додавання кожної повинен випадати білий осад, що свідчить про протікання реакції.
Додавали спочатку 1/3 розрахованого об'єму розчину цітавлона до розчину оліг...
