електрофорез.
Здатність до гібридизації двох препаратів ДНК служить суворим тестом на компліментарність їх послідовностей. Існують два основних способи проведення реакції - це гібридизація в розчині і гібридизація на фільтрі .
У разі гібридизації в розчині препарати одноцепочечной ДНК змішують і отжигают безпосередньо в розчині. Даний спосіб має істотний недолік: ланцюги препаратів ДНК можуть одночасно ренатуріровать з утворенням як гібридних, так і вихідних дволанцюжкових молекул ДНК. Оскільки обидві реакції конкурують між собою, то важко оцінити ступінь гібридизації.
Цей недолік легко подолати, якщо один з препаратів ДНК иммобилизовать так, щоб він не міг ренатуріровать. Для цієї мети використовують нітроцеллюлозний або нейлоновий фільтри (мембрани), на поверхні яких адсорбують одноцепочечную ДНК. Потім фільтр з иммобилизованной ДНК інкубують в розчині другого препарату ДНК, який зазвичай містить мітку (радіоактивну, флуоресцентну і т.п.). Гібридизація иммобилизованной ДНК і ДНК зондів (тобто ДНК, що містить мітку) відбувається тільки в тому випадку, якщо їх послідовності комплементарні.
Аналіз результатів гібридизації проводять по мітці, що залишилася на фільтрі. Цей спосіб гібридизації використовується в багатьох методах криміналістичного ДНК-аналізу.
Фрагменти ДНК різної довжини можуть бути Фракціоновані методом електрофорезу . Цей метод є найважливішим методом дослідження ДНК і широко використовується в криміналістичному ДНК-аналізі. Середовищем для електрофорезу служать агарозній або поліакриламідні гелі, що формують сітчасту структуру з величиною осередків, сумірною з величиною молекули ДНК. Перед електрофорезом проби ДНК вносять у спеціальні лунки гелю, яким буде відповідати його доріжки . Після накладення електричного поля фрагменти ДНК (що мають негативний заряд) починають переміщатися до анода (позитивно зарядженого електроду), випробовуючи опір сітчастої середовища гелю. Чим коротше фрагмент, тим менший опір він випробовує і тим швидше він рухається (швидкість міграції обернено пропорційна логарифму довжини фрагмента). У результаті електрофорезу в гелі утворюються смуги (рис.5). Ті смуги, які розташовуються ближче до анода, відповідають меншим по довжині фрагментами, а ті, які далі, - великим. Для визначення довжини фрагментів ДНК на гель наносять спеціальний маркер , тобто пробу, яка містить суміш фрагментів відомої довжини. Орієнтуючись на розташування смуг маркера і смуги фрагмента ДНК невідомого розміру, встановлюють його довжину (див. Додаток).
2.2 Синтез ДНК: полімеразна ланцюгова реакція
Наявність у ДНК таких властивостей, як можливість поділу полінуклеотидних ланцюгів і принцип комплементарного з'єднання азотистих основ, припускає, що кожна окрема ланцюг ДНК може служити матрицею для побудови другого комплементарної ланцюга, тобто інформація, необхідна для відтворення послідовності основ у ДНК, закладена в структурі її подвійної спіралі. Такий механізм синтезу ДНК, коли в результаті утворюються дві молекули, в яких одна ланцюг складається з вихідної батьківської ланцюга, а друга синтезована на її основі, називають напівконсервативним .
напівконсервативної синтез являє собою складний ферментативний процес. Основним ферментом, відповідальним за синтез нового ланцюга, є ДНК- полімераза . Даний фермент має властивість подовжувати ланцюг ДНК, послідовно приєднуючи по одному нуклеотиду до 3 -кінців (рис.6), здійснюючи синтез в напрямку 5 - 3 '. ДНК-полімераза самостійно не може ініціювати синтез на одноцепочечной ДНК; для цього необхідний невелику ділянку дволанцюжкової ДНК. Щоб його створити та ініціювати синтез, до матричної ДНК додають короткий фрагмент одноцепочечной ДНК (близько 20 п. Н.), Званий ДНК- затравкой або праймером . Нуклеотидная послідовність ДНК-затравки повинна бути комплементарна певної ділянки матричної ДНК. Попередниками синтезу ДНК і джерелом енергії для реакції є нуклеозидтрифосфат (dNTP), які в процесі цієї реакції втрачають дві кінцівки фосфатні групи. Вибір нуклеотиду, який додається до ланцюга, визначається комплементарностью підстав.
На основі напівконсервативної синтезу ДНК в 1985 р Мюлліса був відкритий універсальний метод синтезу заданій послідовності ДНК, названий методом полімеразної ланцюгової реакції ( ПЛР - Polymerase chain reaction, PCR ) [4, 5]. ПЛР являє собою циклічний процес, здійснюваний за участю ДНК-полімерази і забезпечує амплификацию (...
