ля апліфікаціі повнорозмірного гена малої рибосомной субодиниці використовували праймери, розроблені для озерного осетра. PCR-ампліфікацію проводили в 20 мкл реакційної суміші, що містить 100мм Tris-HCl (pH=8.3), 500 мМ KCl, 0.25 мМ кожного dNTP, 90 нг тотальної ДНК, 10 pM кожного праймера, 1.5 мМ MgCl 2 та 1 од. суміші Taq / Pfu (8/1). Умови реакції: початкова денатурація - 94 ° C - 3 хв, потім 35 циклів - 94 ° С - 1 хв, 55 ° C - 2 хв, 68 ° C - 4 хв; додатковий синтез 72 ° C - 15 хв. Реакція завершувалася охолодженням суміші до 4 ° C.
Рис. 2. Транскрипційних одиниця рДНК в тандемних повторах різних (гомологічних і / або негомологічних) хромосом. ETS - зовнішній транскрібіруемих спейсер, ITS - внутрішній транскрібіруемих спейсер; IGS - нетранскірібіруемий спейсер. На деталізації РНК малої рибосомной субодиниці показані використані для ампліфікації і секвенування праймери, а також їх орієнтація (за Krieger, Fuerst, 2002).
Таблиця 1. Список використаних праймерів.
ПраймерПоследовательность (5 «? 3») Tm (°C)Направление570gctattggagctggaattac46.0Обратный570Cgtaattccagctccaatagc46.0Прямой892Cgtcagaggtgaaattcttgg46.0Прямой1262gaacggccatgcaccac52.4Обратный1200Ccaggtctgtgatgccc42.9Прямой18S- Pg - fcaacctggttgatcctgccagt68.0Прямой18S - Pg - rctgatccttctgcaggttcacctac65.0Обратний
2.3 Клонування 18S pДНК
Клонування проволітся через вбудовування по липким кінців з використанням InsT / Aclone PCR Product Cloning Kit (Fermentas) (рис. 3-4).
Лигирование здійснювали в 16 мкл суміші, що містить до 5 од. Т4 ДНК-лігази, 2 мкл плазмідної вектора, 5 мкл PCR-продукту, 3 мкл 10X буфера, 1.5 мкл поліетиленгліколю (PEG 4000) і 2.0 мкл АТФ. Суміш інкубували при 22 ° С від 2 до 16 годин.
Процедура клонування включала наступні етапи:
. Бактеріальну культуру підрощують в середовищі С-medium близько 1 години.
. Готували розчин TransformAid TM T-solution шляхом змішування рівних об'ємів компонентів А і В. Готовий розчин зберігався на льоду;
. Середу з бактеріями центрифугировали при 7000 оборотах 1 хвилину при 4 ° С, супернатант зливали;
. Бактеріальний осад ресуспендували в 300 мкл T-solution, і ставили на 5 хв на лід;
. Клітини повторно центрифугували при тих же умовах, супернатант зливали;
. Осад ресуспендували в 120 мкл T-solution, і ставили на 5 хв на лід; 2.5 мкл лігірованной суміші також ставили на лід на 2 хв;
. У пробірку з лігірованной сумішшю додавали 50мкл бактерій в T-solution, пробірку ставили на лід на 5 хв, після чого клітини висівали на чашку з LB-ампіціліновим агаром і ставили в термостат, розігрітий до 37 ° С на 16-18 годин.
Рис. 3 Схема плазмідної вектора pTZ57R / T. MCS - універсальний сайт для клонування
Рис. 4. Схема лигирования по липким кінців (T / A-клонування)
Перевірку наявності вставки проводили шляхом ампліфікації з праймерами М13 (- 20) (Сінтол) за таких умов: початкова денатурація - 96 ° С - 5 хв, потім 30 циклів - 96 ° С - 30 сек, 55 ° С - 30 сек, 72 ° С - 4 хв. Завершувалася програма додатковим синтезом протягом 40 хвилин.
