gn="justify"> 2.4 Секвенирование послідовності 18S РДНК
Секвенирование здійснювали на автоматичному лазерному секвенатор ABI Prism 3130. Реакцію секвенування проводили в 10 мкл реакційної суміші, що містить близько 10 нг 18S РДНК, 1 ПКМ праймера і 1 мкл BigDie Terminator v. 3.1. Секвенування повнорозмірною послідовності здійснювали з використанням праймерів М13 (- 20) і внутрішніх праймерів (див. табл. 1). Умови реакції були наступними: 96 ° С - 1хв, потім 25 циклів: 96 ° С - 30 сек, 50 ° С - 15 сек, 60 ° С - 4 хв. Очищення включала осадження ацетатом натрію і ізопропанолом і подальшу відмивання 96% етанолом. Перед секвенуванням в пробірку з висушеним продуктом додавали 13 мкл Hi-Di формамід, суміш потім піддавали двохвилинній денатурації при 94 ° С.
2.5 Обробка даних секвенування 18S РДНК
Збірку і вирівнювання послідовностей гена 18S рРНК, а також розрахунок генетичних дистанцій проводили з використанням пакету програм Mega v. 4 (Kumar et. Al., 2004). Розрахунок параметрів різноманітності і генетичної структури популяцій проводили за допомогою програми DnaSp v. 5.
Рівень гаплотіпіческого (аллельного) різноманітності розраховувався як відношення числа гаплотипов (алелей) до загального числа послідовностей.
Середнє число попарних відмінностей розраховувалося за формулою (Tajima, 1983):
, де
ij - кількість мутацій, що відбулися з моменту дивергенції шаплотіпов i і j;
h - число гаплотипов;
pi - частота гаплотипу i, pj - частота гаплотипу j;
n - розмір вибірки
нуклеотидном різноманітність розраховувалося за формулою (Tajima, 1983):
, де
ij - кількість мутацій, що відбулися з моменту дивергенції шаплотіпов i і j;
h - число гаплотипов;
pi - частота гаплотипу i, pj - частота гаплотипу j;
n - розмір вибірки;
L - кількість локусів (сайтів);
2.6 Тести для псевдогенов
Втрата функціональних обмежень і ослаблене дію відбору на псевдогенов послідовності, теоретично, може виражатися в підвищенні швидкостей їх еволюції. Це припущення ми спробували перевірити за допомогою двукластерного тесту (Takezaki et al., 1995). Принцип цього тесту полягає в перевірці рівності середніх частот замін для двох кластерів, утворених вузлом (точкою розгалуження) даного древа. Позначимо ці кластери як А і В, а утворюють їх вузол - N. Решта послідовності можна позначити як С. Тоді середня кількість спостережуваних (оцінених) замін на сайт (дистанція) від вузла N до кінців кластерів А і В буде позначено як bA і bB , відповідно. Якщо припустити сталість частот замін, то очікуване відмінність (d) між bA і bB буде нульовим. Нехай LAB, LAC і LBC - середні дистанції між кластерами А і В, А і С і В та С, відповідно. Тоді:
ij - відстань між послідовностями i і j, nA, nB і nc - кількість послідовностей, що входять в кластери А, В і С, відповідно.
Звідси:
Отже, або. Якщо швидкість еволюції кластера А повільніше, ніж В, значення d буде негативним.
Відхилення d від нуля можна перевірити за допомогою двуконцевого (two-tailed) тесту нормальних відхилень, використовуючи статистичну величину Z.
Щоб відхилити гіпотезу про постійність швидкостей нуклеотидних за...
