стабільних гетеродуплексов, здатність проникати в клітку. p align="justify"> Експеримент з В«виключеннюВ» гена антисмислового олігонуклеотидами включає в себе кілька етапів:
1. Вибір і проведення необхідних для ефективного антисмислового дії хімічних модифікацій олігонуклеотиду.
2. Оптимізація умов проведення ВІД ПЛР реального як методу, кількісно вимірює кількість молекул РНК, що містять ген-мішень.
. Доставка антісмилових олігонуклеотидів в клітини.
. Кількісна характеристика антисмислового дії: порівняння кількості мРНК-мішені в клітинах, оброблених модифікованим і немодифікованим олігонуклеотидами, і в інтактних клітинах.
Якщо кількість мРНК-мішені в клітинах, оброблених антисмислового олігонуклеотидами, мало в порівнянні з кількістю мРНК-мішені в інтактних клітинах, то антисмислової олигонуклеотид ефективно пригнічує експресію гена-мішені. Адекватно підібраний ряд хімічних модифікацій повинен підсилювати антисмислової ефект. p align="justify"> Антісмиловой агент, ефективно інгібує продукцію патогенного білка, має пройти ще ряд доклінічних і клінічних випробувань, перш ніж стати продажним медикаментом.
У даний роботі в якості моделі дослідження був обраний ген EGFP, який продукує флюоресцирующий білок. Перевагою обраної моделі є можливість вимірювання експресії гена-мішені двома методами: ВІД ПЛР та вимірювання інтенсивності флюоресценції, виробленої білком, кодуються геном-мішенню. p align="justify"> Був проведений синтез 5 -монопіренільних кон'югатів двох антісмилових ODN, адресованих до мРНК-мішені (EGFP-A, EGFP-B), і одного В«змішаногоВ» (scrambled) олігонуклеотиду (Scr-1), що містить розкидані і перемішані ділянки антисмислової послідовності. Також були оптимізовані умови проведення ВІД ПЛР як методу діагностики наявності генів EGFP в зразках РНК, виділених з клітин.
3.1 Синтез піренільних похідних олігодезоксінуклеотідов
Синтез проводили за методикою, описаною в п. 2.7. Процедуру кон'югації можна розділити на 2 етапи: активація 5 -кінцевого фосфату (рис. 15, а, б) і приєднання похідного пірену (рис 15, в). Механізм реакції можна представити наступною схемою:
В В
Рис. 15. Механізм приєднання Піренеї-1-метиламіну до 5 -кінцевого фосфату олігонуклеотиду.
В
Рис. 16. а - хроматограмма монопіренільного похідного ODN EGFP-B; б - УФ спектри поглинання продуктів, що містяться в піках (1) і (2).
Були отримані і охарактеризовані методом затримки в гелі і УФ-спектрометрією кон'югати ODN і Піренеї-1-метиламіну. ...
