Затримка в гелі, УФ спектри та спектри флюоресценції свідчать про отримання монопіренільних похідних. p align="justify"> УФ спектр основного продукту реакції, зняті хроматографом Waters, має максимуми в області 260 нм, характерний для олігонуклеотидних частини, і 350 нм, характерний для ароматичної системи залишку пірену. Спектри кон'югатів різних ODN аналогічні
Аналіз продуктів методом електрофорезу в ПААГ в денатуруючих умовах показав зелене флюоресцентних світіння бенду в гелі, характерне для піренових кон'югатів, і невелику затримку кон'югатів в гелі у порівнянні з вихідними олігонуклеотидами, що характерно для монопроізводних.
3.2 Порівняння ефективності виділення РНК з клітин методом хлороформ-фенольної екстракції і за допомогою набору Gen Elute в„ў Mammalian Total RNA Kit В»фірмиВ« Sigma В»
Були отримані суспензії клітин лінії R1198, що містять по 3,6 10 6 клітин. З кожної суспензії клітин виділяли В«сумарнаВ» РНК обома методами і порівнювали ефективність виділення. Критеріями ефективності виділення служили поглинання на довжині хвилі 260 нм (кількісна характеристика) і ставлення оптичної щільності на довжинах хвиль 260 нм і 280 нм (для чистої РНК воно має бути близько до 1,8).
В обох випадках на агарозному гелі після проведення в ньому електрофорезу була отримана якісна картина, характерна для В«сумарноюВ» РНК:
Спектрофотометричні дані показали більш ефективне виділення РНК набором Gen Elute в„ў Mammalian Total RNA Kit В»фірмиВ« Sigma В»у порівнянні з класичним методом хлороформ-фенольної екстракції:
Таблиця 8. Порівняння ефективності методів виділення РНК з клітин. p align="justify"> Метод виделеніяA260, о.е./млA260/A280Хлороформ-фенольная екстракція2, 21,909 Використання набору для виділення РНК9, 91,800
Таким чином, виділення методом хлороформ-фенольної екстракції програє набору для виділення РНК фірми В«SigmaВ» у плані значнішого кількості домішок ДНК, в 4,5 рази меншої кількості виділеної РНК і великих витрат часу на процес виділення .
3.3 Постановка методу ПЛР для визначення мРНК гена EGFP
Була проведена ПЛР з використанням пар праймерів EGFP-1, 2, EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6, адресованих до гену EGFP. Позитивним контролем (при використанні якого достовірно йде ампліфікація) була пара праймерів AE-7, 6, адресованих до гену AML-ETO. В якості ДНК-матриці використовували кДНК, отриману з клітин лінії R1198 і містить амплікони обох генів. На рис. 20 наведена фотографія прокрашенного бромистим етидієм агарозного гелю після поділу в ньому продуктів ПЛР. p align="justify"> EGFP-1, 2 (доріжки 1,2), EGFP-3, 2 (доріжки 3,4),
EGFP-5, 6 (доріжки 5,...
